孫竹梅 趙雅寧△ 李建民 王國立 陳長香 張美航 王 靜

(1 華北理工大學臨床醫(yī)學院, 2 唐山市開灤總醫(yī)院, 唐山 063000)

缺血性腦血管病作為我國常見病和高發(fā)病嚴重威脅人類健康[1-4]。腦缺血所導致的神經元損傷是誘發(fā)神經功能缺失的關鍵所在。尋找減少神經元損傷的有效干預方法,對腦缺血類疾病的預防及功能恢復有深遠意義。有研究表明[5-6],腦缺血發(fā)生前進行運動訓練能夠使腦組織對后續(xù)發(fā)生的嚴重損傷產生耐受能力,對大腦的神經功能有保護作用。然而,其具體機制以及運動的強度等問題有待進一步闡明。軸突的準確投射與其形成、生長對神經再生有重要作用[7]。內源性再生相關因子生長相關蛋白-43(growth associated protein-43, GAP-43),是調節(jié)軸突形成新聯系和引導軸突生長的一種快速轉運胞膜磷酸蛋白[8-9]。而髓鞘相關蛋白神經突起生長抑制分子中,軸突生長抑制因子-A(neurite outgrowth inhibitor-A, Nogo-A)對神經生長具有強烈的抑制作用[10-11]。本研究通過建立不同強度運動預處理的腦缺血模型,觀察實驗大鼠海馬區(qū)GAP-43、Nogo-A的表達變化及神經細胞丟失的變化,初步探討兩者在不同強度的運動預處理全腦缺血大鼠神經元損傷中的作用,旨在為腦缺血的預防及預后提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

多克隆GAP-43抗體和多克隆Nogo-A抗體(北京博奧森生物技術有限公司);兩步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司);One Step SYBR?PrimeScriptTM PLUS RT-PCR Kit, RNAiso Plus(大連寶生物工程有限公司);引物(上海生工生物工程股份有限公司);ZH-PT型計算機控制動物實驗跑臺(安徽正華生物儀器設備有限公司);5417R冷凍離心機(德國Eppendorf公司);旋渦混勻器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)。

1.2 實驗動物分組和處理

80只3月齡雄性SD大鼠由北京維通利華公司提供(SCXK(京)2003-003),體質量230～310g。隨機平均分成假手術組、腦缺血再灌注組(I/R組)、運動強度1預處理組、運動強度2預處理組。分別作如下處理： 假手術組分離暴露血管,但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈;腦缺血再灌注組應用改良的Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法[5]制備全腦缺血模型,動物術前12h禁食,常規(guī)水合氯醛麻醉,頸正中切口,分離出雙側頸總動脈,在其下置線備用。隨后將大鼠翻正并用立體定位儀固定頭頸部,枕后部正中切口,暴露雙側第1頸椎橫凸翼孔,直視下電凝其下通過的椎動脈,每次電凝時間約為2～4s,使其永久閉塞。術后大鼠縫皮回籠,待恢復24h后以無創(chuàng)性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈,缺血10min后松開動脈夾,以實現再灌注。

參照筆者前期所用方法[12],本研究選取2組健康大鼠作為運動預處理組,于每日9：00點開始跑臺運動,跑臺坡度設置為0°。首先進行為期7d的適應性跑臺訓練(以10、15、20m/min的速度分別持續(xù)10min),待大鼠熟悉跑臺設備并能維持運動(以20m/min的速度持續(xù)30min)時開始建模,持續(xù)14d,總時程為21d。運動強度1預處理組設置速度為20m/min,時間為30min(相當于30% VO2max);運動強度2預處理組則采用遞增強度的方式進行跑臺訓練,設置開始的速度為10m/min,逐漸提高速度并在3min內達到預定速度(19.3m/min,相當于70% VO2max。運動預處理后立即制備成全腦缺血再灌注模型。

每組又隨機平均分為6h,1、3、7d時間亞組,各時間點n=5。分別進行以下檢測。

1.3 組織標本制備

按時間點對各組大鼠用10%水合氯醛(300～350mg/kg)腹腔注射麻醉, 4%多聚甲醛固定心灌流,切取約2mm 厚度冠狀背側海馬切片, 4℃4%多聚甲醛固定。24h以后對腦組織進行常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片與貼片,切片厚度為4μm,45℃恒溫箱中烤干待用。同一層面相同切片進行H-E染色和免疫組織化學顯色。

1.4 GAP-43、Nogo-A免疫組織化學顯色

切片常規(guī)脫蠟至去離子水,滴加復合消化液后加入37℃溫箱孵育20min,經PBS洗滌,入3% H2O2封閉內源性過氧化物酶15min,經PBS洗滌后滴加兔抗大鼠GAP-43和Nogo-A多克隆抗體(1∶300稀釋),4℃過夜;PBS洗滌后滴加生物素化二抗,37℃ 40min,PBS洗滌;DAB顯色,蘇木精輕度復染,脫水透明,封片。用0.01mol/L PBS代替一抗孵育作為陰性對照。應用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng),采用陽性細胞計數法,在相同光鏡倍數(40×10)下每只大鼠每個指標選取5張腦組織切片,每一張切片在高倍視野鏡下隨機選取5個不重疊視野,計算每個視野的陽性細胞數,及棕黃色顆粒細胞,取均數作為每組該指標陽性細胞數。

1.5 組織材料的處理及總RNA提取

按時間點處死動物,冰上取出海馬組織,加入1ml RNAiso Plus溶液后勻漿,室溫靜置5min后12000r/min 4℃離心5min,取上清移至新的1.5ml離心管內,加入1/5 RNAiso Plus溶液體積的氯仿,震蕩混勻后室溫靜置5min,12000r/min 4℃離心15min,取上清液,加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液體積的異丙醇,室溫靜置10min,12000r/min 4℃離心10min,棄掉上清液,用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀,7500r/min 4℃離心5min,棄上清保留沉淀,干燥(不可加熱),溶解于30μl DEPC處理水中,測量OD260/280值,根據OD260計算RNA濃度,-80℃保存。

1.6 引物合成

參照CenBank公布的GAP-43、Nogo-A和GAPDH序列,由上海生工生物技術有限公司合成(表1)。

1.7 RT-PCR

應用ABI PRISM?7000和Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法,配置反應體系為20μl的反應液。進行Real Time One Step RT-PCR反應： Stage1、2(反轉錄反應)： Reps，1,42℃ 5min,95℃ 10s;Stage3(PCR反應)： Reps，40,95℃ 5s,60℃ 31s;Stage4(融解曲線分析)： Dissociation Protocol。

表1 PCR引物設計

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察

假手術組中神經元結構正常,細胞核規(guī)則,核仁清晰。與假手術組比較,I/R組神經元細胞胞體呈三角形,核皺縮深染,胞質嗜伊紅,存活神經元數量隨缺血時間延長而減少,以3d時神經細胞壞死情況最為顯著(P<0.01)。運動強度1預處理組存活神經元細胞數量明顯高于I/R組,細胞核固縮深染及水腫情況減輕;而運動強度2組存活神經元數量進一步減少,神經元細胞固縮、深染情況顯著,出現較多細胞核丟失、空泡狀的非正常形態(tài)神經元細胞(圖1,表2)。

表2 各組大鼠海馬區(qū)神經元細胞壞死率的比較±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsI/R

2.2 GAP-43、Nogo-A陽性細胞數量及表達

免疫組織化學檢測GAP-43、Nogo-A陽性表達主要位于細胞核,陽性細胞的胞質可見細小的棕黃色顆粒。假手術組可見GAP-43、Nogo-A在胞質有弱表達。與假手術組比較,腦缺血再灌注各組GAP-43、Nogo-A的表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。運動強度1預處理組GAP-43蛋白呈較高水平表達,并隨時間延長呈遞增趨勢,于7d時達高峰,各時間點均顯著高于I/R組(P<0.01);而運動強度2預處理組GAP-43蛋白表達顯著低于運動強度1預處理組和I/R組(P<0.01)。此外,運動強度1預處理組Nogo-A在6h 時明顯減少,并在1d時達低值,3d時有所上升,7d時達高值,但仍低于I/R組(P<0.01);運動強度2預處理組Nogo-A蛋白表達顯著高于運動強度1預處理組和I/R組(P<0.01)(圖2)。

2.3 各組大鼠腦組織海馬區(qū)GAP-43、Nogo-A mRNA的表達

應用相對定量方法比較目的基因和內參基因之間的表達差異,采用2-△△Ct計算法顯示實時定量PCR實驗中基因表達的相對濃度。與假手術組比較,I/R組各時間點GAP-43、Nogo-A mRNA表達水平顯著增加(P<0.01)。運動強度1預處理組GAP-43 mRNA呈較高水平表達,并隨時間延長呈遞增趨勢,于7d時達高峰,各時間點均顯著高于I/R組(P<0.01);而運動強度2預處理組GAP-43 mRNA表達顯著低于運動強度1預處理組和I/R組(P<0.01)。此外,運動強度1預處理組Nogo-A mRNA表達在6h時明顯減少,并在1d時達低值,3d時有所上升,7d時達高值,但仍低于I/R組(P<0.01);運動強度2預處理組Nogo-A mRNA表達顯著高于運動強度1預處理組和I/R組(P<0.01)(表3、4)。

表3 各組動物海馬區(qū)GAP-43 mRNA的表達±s)

*P<0.05vssham group;△P<0.05vsI/R group

表4 各組動物海馬區(qū)Nogo-A mRNA的表達±s)

*P<0.05vssham;△P<0.05vsI/R

圖1 缺血3d各組海馬區(qū)CA1區(qū)神經元的H-E染色,×400。A： 假手術組；B： I/R組；C： 運動強度1預處理組；D： 運動強度2預處理組.

圖2 缺血3d各組大鼠CA1區(qū)GAP-43(A1～D1)和Nogo-A(A2～D2)免疫組織化學顯色,×400。A1/A2： 假手術組；B1/B2： I/R組；C1/C2： 運動強度1預處理組；D1/D2： 運動強度2預處理組.

Fig 1 H-E staining of neurons in the hippocampal CA1 region 3d after I/R in each group, ×400. A: Sham group; B: I/R group; C: Exercise intensity 1 group; D: Exercise intensity 2 group.

Fig 2 Immunohistochemistry staining of GAP-43 (A1-D1) and Nogo-A (A2-D2) in the hippocampal CA1 region 3d after I/R in each group, ×400. A1/A2： Sham group; B1/B2： I/R group; C1/C2： Exercise intensity 1 group; D1/D2： Exercise intensity 2 group.

3 討論

本研究結果顯示,與假手術組比較,運動強度1預處理促使腦缺血大鼠海馬區(qū)的神經元細胞存活數目增多,而運動強度2預處理則加重了腦組織的缺血缺氧程度,使神經元細胞出現進行性壞死。提示運動訓練預處理對腦組織的保護作用因強度差異而產生截然不同的效果。為探究其機制,觀察了實驗大鼠海馬區(qū)GAP-43與Nogo-A的表達變化。

GAP-43是神經組織特異性磷酸蛋白質,是神經元發(fā)育及神經生長、再生標志蛋白[13]。Nogo-A是一種神經軸突生長相關蛋白,是抑制中樞神經結構重塑與再生的主要物質[14]。近年來,有學者[14-16]報道利用針康法、淫羊藿苷以及低氧療法等上調了腦缺血區(qū)皮層GAP-43的表達,達到促使腦缺血大鼠腦缺血后神經再生和恢復功能的作用;更有學者在大鼠局灶性腦缺血模型中通過電針、康復訓練、中藥、Nogo-A受體拮抗劑等手段進行干預,表明抑制Nogo-A的表達可增強存活腦區(qū)神經元的修復再生,部分重建喪失的神經功能。

研究結果顯示,運動強度1預處理訓練能夠上調腦缺血大鼠腦組織GAP-43的表達,抑制Nogo-A的表達,并提高其下降速度,使其在更短時間內降至較低水平,從而維持神經元的正常發(fā)育和存活,促使缺血損傷后突觸的形成及出芽。李超等[17]在腦梗死大鼠模型中證實,每天10min的跑籠訓練可促使大鼠抓握力的恢復,梗死灶周圍神經元數量顯著增多,且使Nogo-A蛋白水平表達下調,改善軸突生長的微環(huán)境。提示運動強度1預處理通過減慢GAP-43隨著時間延長而表達降低的幅度,抑制Nogo-A的表達水平,為軸突再生提供基礎,加強了神經細胞軸突的修復和突觸間的連接再塑,進而使中樞神經功能的恢復得到進一步改善。

研究還表明,運動強度2預處理使腦缺血大鼠腦組織海馬區(qū)GAP-43表達進一步降低。Nogo-A表達增加并大量釋放,造成神經元的不可逆損害,加重缺血損傷。樊振勇等[18]研究認為,腦缺血再灌注后,GAP-43表達增強可能與損傷神經的功能恢復相關,運動訓練的介入激活了神經元，促進了神經元軸突的神經突觸的連接重建以及修復、再生[19]。但大強度的極限負荷造成大鼠機體疲勞,過多的跑臺運動并不利于大鼠海馬神經細胞的再生,這種大強度的劇烈運動使海馬神經元發(fā)生形態(tài)和功能變化,突觸傳遞效能下降,海馬的神經元興奮性降低[20]。以上研究結果提示,運動強度2預處理誘導的氧自由基堆積,打破微環(huán)境平衡,促使Nogo-A過表達,打破機體內平衡狀態(tài),發(fā)揮抑制神經再生的作用,同時下調GAP-43而抑制神經再生,加重大鼠腦缺血再灌注后神經功能損傷,引起中樞神經系統(tǒng)結構機能的紊亂或下降。

綜上所述,Nogo-A蛋白的表達會使腦損傷的進程加速,而GAP-43基因的表達促進腦損傷修復和神經再生。兩者相互制約和依存,協同調控機體內環(huán)境的平衡。運動訓練可以促進腦缺血大鼠梗死灶周圍軸突出芽,但是由于受到不利微環(huán)境的影響,如運動強度和髓鞘形成抑制因子的影響,軸突再生受到很大程度的限制,影響功能的恢復。本研究結果提示,不同強度運動訓練對大鼠神經功能恢復及腦組織結構具有截然不同的作用,與調控腦組織海馬區(qū)GAP-43和Nogo-A的表達有關。