楊 寧 董 彬 傅 莉 王嘉鈺 黃 煜 任麗莉 金梅花 韓東河

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 錦州 121001)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是脊柱損傷的嚴(yán)重并發(fā)癥,目前國內(nèi)外治療SCI的藥物和外科手術(shù)均未取得令人滿意的臨床療效[1-2]。脊髓損傷后數(shù)小時到數(shù)周之內(nèi),即繼發(fā)性損傷,會發(fā)生一系列神經(jīng)細胞和分子水平上的病理反應(yīng),引起細胞進一步壞死和凋亡,最終形成髓鞘剝脫和軸突的萎縮退變[3-5]。近年來,一些研究指出,抗衰老基因克老素與神經(jīng)退行性疾病有著密切的相互聯(lián)系,可能通過抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡發(fā)揮其抗衰老的作用[6-8]。已知克老素基因敲除小鼠與野生型小鼠相比,表現(xiàn)為其認知功能障礙,且認知障礙的克老素基因敲除小鼠出現(xiàn)凋亡細胞數(shù)的增加，海馬內(nèi)脂質(zhì)和DNA氧化水平顯著提高,但克老素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達以及神經(jīng)損傷中的作用及機制尚不清楚。為此,本研究將利用脊髓損傷動物模型,觀察克老素在脊髓神經(jīng)元中的表達變化,分析克老素的表達變化與神經(jīng)損傷之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

50只清潔健康2月齡雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20) g,均由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,動物許可證號： SCXK(遼)2003-0007。將大鼠隨機分為正常對照組(Sham)，損傷1周、2周、4周組(SCI 1 week, SCI 2 weeks, SCI 4 weeks)。

1.2 建立SCI動物模型

在腹腔注射4%水合氯醛(5ml/kg)進行麻醉,對大鼠背部脫毛、常規(guī)消毒、鋪洞巾,將大鼠俯臥位并固定于立體定位儀上;以第9胸椎(T9)棘突為中心,尖刀背部縱行切開長2～3cm創(chuàng)口,鈍性分離皮下組織和肌肉,暴露脊柱椎骨T8～T10棘突和椎板,用咬骨鉗慢慢咬除椎板并暴露硬脊膜;用寬度1.0mm的動脈瘤夾(規(guī)格為50g力),壓迫T9～T10段脊髓1min;大鼠隨即出現(xiàn)擺尾、雙后肢和軀體抽縮撲動后,雙后肢癱瘓;觀察并止血,鹽水沖洗切口,用手術(shù)線分層縫合肌肉軟組織及皮膚,模型制作完成。模型制作完成后,立即腹腔注射37℃生理鹽水5ml以補充丟失的體液。術(shù)后24h內(nèi),注意保溫并嚴(yán)格術(shù)后觀察。術(shù)后常規(guī)護理以青霉素4×104U/d,連續(xù)5d。每天各在早晚8：00定時以膀胱按摩協(xié)助大鼠排尿,直到本實驗結(jié)束。Sham組僅打開椎板,然后縫合。

1.3 RT-PCR法檢測克老素基因的變化

根據(jù)產(chǎn)品說明書,提取組織總RNA,取約1μg總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄。在PCR儀上設(shè)定逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件： 37℃ 10min,42℃ 30min,70℃ 5min,4℃。取1μl 合成好的cDNA,配好PCR反應(yīng)液,進行擴增?？死纤匾镄蛄?5′-3′)為： Forward： CAATGGCTTCC CTCCTTTAC,Reverse： AGCACAGGTTTGCGTAG TCT(450bp)。內(nèi)參GAPDH引物序列 (5′-3′)為： Forward： CTACCCACGGCAAGTTCAAT, Reverse： GGATGCAGGGATGATGTT(478bp)。PCR反應(yīng)條件： 克老素為94℃ 30s, 55℃ 40s,72℃ 1min,29個循環(huán);GAPDH為94℃30s, 55℃ 40s,72℃ 1min,29個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進行電泳,并對PCR電泳條帶進行灰度分析,以GAPDH作為內(nèi)參,根據(jù)目的基因灰度值/內(nèi)參灰度值,計算出克老素基因的相對表達量。

1.4 免疫熒光染色法觀察克老素在脊髓的表達變化

各組脊髓組織切片,經(jīng)固定、封閉后,用兔抗大鼠Klotho(1∶100,美國Abcam)4℃孵育過夜,予羊抗兔 FITC-IgG(1∶100,美國Abcam)避光室溫孵育(未行DAPI核染色), 封片劑封片后在激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss)下觀察并拍照。

1.5 蛋白印跡檢測克老素的表達變化

各組脊髓組織剪碎后加入全蛋白裂解液, 提取總蛋白,用BCA法進行定量,將蛋白濃度最終定為0.8μg/μl，取10μg行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h;TBST洗膜,一抗Klotho(1∶500)4℃孵育過夜;洗膜3次,相應(yīng)二抗(1∶2000)室溫孵育2h,洗膜3次;暗室ECL發(fā)光顯色、曝光、拍照,Image J分析結(jié)果。

1.6 ELISA法檢測大鼠脊髓損傷后氧化損傷程度

取大鼠脊髓組織蛋白液,利用稀釋液1∶5稀釋蛋白提取液,檢測8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量,并按試劑盒說明書操作。每份樣本做2個平行樣。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓組織中克老素mRNA的表達變化

結(jié)果顯示,損傷組大鼠脊髓中克老素基因表達較假手術(shù)組低,并并隨損傷時間的延長,呈波動性改變,在損傷后1周開始減低,4周時減少到最低(圖1)。

圖1 克老素mRNA在脊髓損傷中的表達變化

2.2 大鼠脊髓組織中克老素蛋白的表達變化

免疫熒光法檢測結(jié)果顯示,克老素在脊髓神經(jīng)組織中表達,且熒光強度隨病程增加,逐漸減弱(圖2)。蛋白電泳定量分析結(jié)果顯示,損傷組大鼠脊髓中,克老素蛋白表達較假手術(shù)組明顯降低,并隨損傷時間的延長,呈波動性改變,在損傷后1周開始減低,4周時減少到最低(圖3)。

圖2 克老素蛋白在脊髓組織中的表達,標(biāo)尺=100μm

圖3 克老素蛋白在脊髓損傷中的表達變化

2.3 大鼠脊髓組織中8-OHdG含量

結(jié)果顯示脊髓損傷組大鼠脊髓中8-OHdG表達水平較假手術(shù)組高,并隨損傷時間的延長,呈波動性改變,在損傷后1周開始增高,4周時增加到最高。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。

圖4 8-OHdG在脊髓損傷中的表達變化

2.4 克老素與8-OHdG相關(guān)性分析

克老素表達(變量X)與8-OHdG濃度(變量Y)進行相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩變量呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.898,P<0.01,n=24)(圖5)。

圖5 克老素與8-OHdG相關(guān)性分析

3 討論

脊髓損傷后局部微環(huán)境變化的大量研究指出,氧化應(yīng)激是加劇脊髓損傷后誘導(dǎo)神經(jīng)細胞和少突膠質(zhì)細胞凋亡的主要因素。尤其在神經(jīng)組織退化過程中小膠質(zhì)細胞通過釋放促炎細胞因子(腫瘤壞死因子α,白介素6等)和活性氧(ROS),在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了舉足輕重的作用[8]。這些因素不僅直接破壞脊髓組織,而且通過介導(dǎo)反應(yīng)性膠質(zhì)化阻止神經(jīng)再生抑制修復(fù),最終導(dǎo)致瘢痕形成,細胞死亡[7]。抗衰老基因——克老素,最初是由日本科學(xué)家Makoto Kuro-o在1997年研究時偶然發(fā)現(xiàn)的,后命名為Klotho基因。隨后經(jīng)研究進一步確認,表明Klotho基因敲除鼠(KL-/-)具有類似人類衰老的表型,如個體壽命的縮短、身長及體質(zhì)量的明顯降低、動脈粥樣硬化、皮膚黏膜和肌肉的萎縮、軟組織鈣化、骨質(zhì)疏松等[9]。近年來,研究表明克老素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[12-13]。如精神認知功能的障礙、大腦運動神經(jīng)元功能障礙、聽力異常等神經(jīng)功能障礙[10-11],但克老素在脊髓組織中的表達研究甚少。

本實驗結(jié)果表明,脊髓損傷后大鼠脊髓組織中的克老素表達較正常組及假損傷組明顯減弱,且克老素的表達隨著脊髓損傷的病理進程逐漸減弱,提示脊髓損傷后大鼠脊髓組織中克老素參與脊髓損傷修復(fù)的病理過程。最近有研究指出克老素蛋白過表達,可以明顯減少血管內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激,胞內(nèi)的凋亡分子caspase-9的活性也隨著明顯降低[14-15]。本研究結(jié)果顯示,細胞內(nèi)DNA氧化損傷指標(biāo)8-OHdG的表達隨脊髓損傷的病理過程而增高,且與克老素的表達呈負相關(guān)關(guān)系，提示克老素可能具有神經(jīng)保護作用。根據(jù)上述結(jié)果,脊髓損傷神經(jīng)元的凋亡的增加是否與克老素的表達具有直接關(guān)系,尚不清楚。因此,進一步在體內(nèi)外實驗中利用基因過表達或沉默技術(shù),調(diào)控克老素的表達,驗證克老素與大鼠脊髓中神經(jīng)細胞的凋亡及運動功能的改變,將具有重要的研究意義。