李瑩瑩 王琳琳 馬琳琳 王 語(yǔ) 肖丹丹 張曉萍 于向民 荊 昭 李 玲

(青島大學(xué)人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系, 青島 266071)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種常見的慢性炎癥疾病[1],是多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ),心血管疾病死亡率上升主要是由于動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病死亡率上升所造成[2]。染料木黃酮是最活躍的天然黃酮類化合物,具有多種生物學(xué)作用,包括抗氧化、抗增殖和抗腫瘤功能等[3]。染料木黃酮作為一種非特異性酪氨酸激酶抑制劑,因其在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)方面對(duì)人類某些心血管疾病,尤其是動(dòng)脈粥樣硬化具有潛在的價(jià)值,所以備受科研工作者關(guān)注[4]。蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)是絲氨酸/蘇氨酸激酶,參與細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng),能夠促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖[5]。目前,染料木黃酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)主要探究了染料木黃酮對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用及其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠高脂飼料(0.25%膽固醇+15%脂肪)、普通飼料購(gòu)買于北京華阜康生物科技股份有限公司;染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(Genistein, GST)由大連市美侖生物技術(shù)公司提供;飽和油紅O染色液(oil red O solution)購(gòu)于索萊寶公司;鼠源p-Akt單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司;兔源Akt單克隆抗體、兔源β-actin單克隆抗體購(gòu)于北京博奧森公司。

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的制備

雄性6周齡C57BL6小鼠50只,體質(zhì)量17～22g,先以普通飼料喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分5組,每組10只： 低濃度染料木黃酮組(左頸總動(dòng)脈套管+高脂飼料+染料木黃酮5mg·kg-1·d-1)、高濃度染料木黃酮組(左頸總動(dòng)脈套管+高脂飼料+染料木黃酮20mg·kg-1·d-1)、阿托伐他汀鈣組(左頸總動(dòng)脈套管+高脂飼料+阿托伐他汀鈣10mg·kg-1·d-1)及模型組(左頸總動(dòng)脈套管+高脂飼料+生理鹽水)、空白對(duì)照組10只(普通飼料+生理鹽水)。藥品均為灌胃處理,室溫19℃～22℃,自然采光,自由飲水,每周測(cè)量體質(zhì)量并記錄。

1.3 血液和動(dòng)脈樣本的采集

實(shí)驗(yàn)第15周,小鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉,股動(dòng)脈取血,解剖小鼠,取左頸總動(dòng)脈1.5～2.0cm,浸入4%多聚甲醛固定。

1.4 血脂檢測(cè)

取血清,送至青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血脂高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清總膽固醇和甘油三酯含量。

1.5 病理學(xué)觀察

將4%多聚甲醛固定的小鼠頸總動(dòng)脈一部分脫水透明后用石蠟包埋,以厚度為5μm連續(xù)切片后H-E染色。另一部分4%多聚甲醛固定的頸總動(dòng)脈用OCT包埋劑包埋后進(jìn)行連續(xù)冰凍切片,厚度約0.6mm,切片后油紅O染色。

1.6 蛋白印跡檢測(cè)p-Akt蛋白表達(dá)

高速組織研磨機(jī)研磨各小組頸總動(dòng)脈組織,加入含有 PMSF和磷酸酶抑制劑的高效 RIPA蛋白酶裂解液提取頸總動(dòng)脈總蛋白,BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每組上樣量為10μg,經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳后,采用濕轉(zhuǎn)法恒壓1h將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂奶粉置于搖床上封閉1h,洗膜,加入一抗 p-Akt(1∶600)和β-actin(1∶1500),4℃孵育過夜,洗膜,加羊抗鼠二抗(1∶5000)室溫孵育1h后,洗膜。PVDF膜上滴入超敏化學(xué)發(fā)光試劑ECL并反應(yīng)2min,用VILBER Fusion FX7成像系統(tǒng)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間成像。成像后用一抗二抗去除液漂洗 PVDF膜,加入TBST漂洗,再次封閉1h,洗膜,加入一抗 Akt(1∶600),以后步驟同上。各組條帶用Image-J分析灰度值。

1.7 免疫熒光檢測(cè)p-Akt蛋白表達(dá)

從-20℃冰箱取出6μm的凍干切片并立刻放入雙蒸水中浸泡10min, PBS洗片,后吸干組織周圍的水分,使載玻片干燥。將切片放入濕盒,用10%的羊血清溶液在室溫下封閉1h。吸干封閉液,用足量的p-Akt一抗溶液完全浸沒切片入濕盒4℃過夜。PBS洗片,切片在濕盒中與相應(yīng)的熒光抗體室溫孵育2h。用足夠量的熒光二抗(1∶250)溶液完全浸沒切片。PBS洗片,將切片孵育核染DAPI約15min。PBS洗片,切片干后,滴加少許抗熒光淬滅劑,緩慢蓋上蓋玻片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量變化

5組小鼠體質(zhì)量在手術(shù)后1～2周略有下降,3～8 周體質(zhì)量增長(zhǎng)較快,此后體質(zhì)量呈緩慢增長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)期間各組間小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 5組小鼠體質(zhì)量變化

2.2 血脂檢測(cè)

空白對(duì)照組,高、低濃度染料木黃酮,阿托伐他汀鈣組與模型組之間血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，染料木黃酮對(duì)于血清中總膽固醇含量無(wú)明顯影響(P>0.05),低濃度染料木黃酮組對(duì)于血清中低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的影響不明顯(P>0.05)。

2.3 H-E染色組織形態(tài)學(xué)

連續(xù)石蠟切片后H-E染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察并記錄小鼠頸總動(dòng)脈套管側(cè)組織學(xué)變化(圖2)。頸總動(dòng)脈空白對(duì)照組(圖2A1)內(nèi)膜光滑,血管管壁薄,管腔內(nèi)無(wú)明顯變化,模型組(圖2E1)內(nèi)膜有斑塊形成,血管管壁略厚。阿托伐他汀鈣對(duì)照組(圖2B1),低、高濃度染料木黃酮組(圖2C1、D1)相比無(wú)明顯區(qū)別。

表1 各組小鼠血脂變化結(jié)果(n=10,±s, mmol/L)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group

2.4 油紅O染色組織形態(tài)學(xué)

連續(xù)冰凍切片油紅O染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察并記錄小鼠頸總動(dòng)脈套管側(cè)脂滴含量變化?？瞻讓?duì)照組(圖2A2)、阿托伐他汀鈣組(圖2B2)、高濃度染料木黃酮組(圖2D2)組織內(nèi)無(wú)明顯脂滴,低濃度染料木黃酮組(圖2C2)組織內(nèi)含有少量脂滴,模型組(圖2E2)頸總動(dòng)脈組織內(nèi)脂滴含量相對(duì)較高。

2.5 免疫印跡檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白Akt表達(dá)情況

對(duì)免疫印跡圖像(圖3)灰度值分析顯示(圖4),低、高濃度染料木黃酮組的蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組相比,高濃度染料木黃酮組與空白對(duì)照組相似,低濃度染料木黃酮組蛋白表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)。低濃度染料木黃酮組p-Akt蛋白表達(dá)量明顯高于阿托伐他汀鈣組(P<0.01)。高濃度染料木黃酮組p-Akt蛋白表達(dá)量明顯低于模型組,低濃度染料木黃酮組 p-Akt蛋白表達(dá)量低于模型組(P<0.01)。據(jù)此推斷,高濃度染料木黃酮組對(duì)于小鼠動(dòng)脈粥樣硬化有明顯的治療效果。

圖3 免疫印跡檢測(cè)p-Akt蛋白含量的表達(dá)

2.6 免疫熒光檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白Akt的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4、5)表明,免疫熒光檢測(cè)p-Akt表達(dá)變化趨勢(shì)與免疫印跡檢測(cè)結(jié)果基本一致。即高、低濃度染料木黃酮組和模型組相比較,p-Akt在高濃度染料木黃酮組的小鼠血管細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯降低(P<0.05)。高、低濃度染料木黃酮組和空白對(duì)照組、阿托伐他汀鈣組相比較,p-Akt在低度染料木黃酮組的小鼠血管細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯增多(P<0.05)。高濃度染料木黃酮組可有效抑制p-Akt的表達(dá),對(duì)于小鼠動(dòng)脈粥樣硬化有明顯的治療效果。

圖5 p-Akt蛋白表達(dá)在各組小鼠頸總動(dòng)脈中的變化

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是對(duì)人類的健康影響最嚴(yán)重、最常見的慢性病之一[6]。同時(shí),動(dòng)脈粥樣硬化還是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ),全球每年大約2000萬(wàn)人死于動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)疾病[7]。

頸總動(dòng)脈內(nèi)置鞘管法可改變血流動(dòng)力學(xué),使血管壁的剪切力發(fā)生一定的改變[8],是構(gòu)建小鼠動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的一種造模方法[9]。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生學(xué)說之一是血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖以及脂質(zhì)的過氧化損傷。動(dòng)脈粥樣硬化的病變閉塞是由于動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的增加,而其厚度增加是由于血管平滑肌細(xì)胞的大量增加,這些血管平滑肌細(xì)胞能夠形成新的結(jié)締組織,從而導(dǎo)致高血脂癥個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外脂質(zhì)積累。血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生中起至關(guān)重要的作用。在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖等過程中,Akt信號(hào)通路都發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。此外,Akt 信號(hào)通路介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)也是非常重要的免疫反應(yīng)通路,能夠調(diào)節(jié)炎癥因子分泌[10]。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中,氧化應(yīng)激、氧化低密度脂蛋白及炎癥因子導(dǎo)致p-Akt 迅速失活,凋亡相關(guān)基因的表達(dá)升高,進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;此外,血管平滑肌的遷移、增殖表型轉(zhuǎn)換以及泡沫細(xì)胞的形成等都和磷酸化Akt的活性相關(guān)聯(lián)[11]。Akt的表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化 的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中起著十分重要的作用[11],通過抑制Akt信號(hào)通路,可延緩動(dòng)脈粥樣硬化的形成及發(fā)展。

盡管動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生在血管內(nèi)壁,但沒有直接針對(duì)血管壁進(jìn)行預(yù)防的臨床藥物。動(dòng)脈粥樣硬化形成的過程中,需要新的靶分子提供治療靶點(diǎn)。目前,他汀類藥物是臨床上常用的降脂藥物,具有多種藥理作用,可以降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[12-14]。諾華生物醫(yī)學(xué)研究院認(rèn)為： 盡管他汀類藥物在治療動(dòng)脈粥樣硬化方面療效顯著,但仍有一部分患者的病情繼續(xù)惡化。因此,尋找其他類別或能夠輔助抑制動(dòng)脈粥樣硬化的新型臨床藥物是有必要的。

相對(duì)男性而言,女性心血管疾病死亡率較低,其中部分原因是由于女性雌激素表達(dá)水平較高。許多研究表明雌激素具有多種生物學(xué)效應(yīng),能夠減輕動(dòng)脈粥樣硬化[15]。染料木黃酮是存在于大豆異黃酮中的重要活性元素,是大豆異黃酮產(chǎn)品中的主要功能成分,屬于植物雌激素的一種,在結(jié)構(gòu)上與17β-雌二醇類似,植物雌激素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[16]。目前,染料木黃酮對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用研究較少,且作用的機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)主要探究了染料木黃酮對(duì)于小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用及相關(guān)作用機(jī)制。

研究表明阿托伐他汀鈣[17]和染料木黃酮[18]能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。本實(shí)驗(yàn)選取阿托伐他汀鈣作為陽(yáng)性對(duì)照組,同樣證明模型組及他汀組血總膽固醇、甘油三酯及低濃度脂蛋白水平高于對(duì)照組,而他汀組血脂水平低于模型組。低、高濃度染料木黃酮組中總膽固醇含量均沒有明顯變化;高濃度染料木黃酮組的高密度脂蛋白含量要高于模型組,效果和阿托伐他汀鈣組相近,但低濃度染料木黃酮組沒有明顯效果。本研究證明,高濃度染料木黃酮干預(yù)組可以有效降低甘油三酯,低密度脂蛋白的含量,同時(shí)提高高密度脂蛋白在血清中的含量,且治療效果與阿托伐他汀鈣組(10mg·kg-1·d-1)相近。

染料木黃酮可以抑制血管炎癥,主要是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-B(nuclear factor kappa B, NF-κB)[19]、核因子E2相關(guān)因子2/血紅素氧合酶-1 (nuclear factor-E2-related factor 2/heme oxygenase-1, Nrf2/HO-1)[20]、磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)[15]和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)[21]信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。阿托伐他汀鈣藥物治療動(dòng)脈粥樣硬化可以減少斑塊的形成[22],研究表明此類藥物對(duì)平滑肌細(xì)胞的增殖也起到了明顯的抑制作用[23],其可能機(jī)制是抑制 p-Akt的活性。血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化引起血管損傷和再狹窄的一個(gè)原因。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展之初血管平滑肌細(xì)胞從收縮型變成分泌型,并遷移到血管內(nèi)膜從而導(dǎo)致內(nèi)膜的增生[15,23]。平滑肌細(xì)胞的異常增殖和Akt信號(hào)通路關(guān)系密切,筆者推測(cè)染料木黃酮可在體內(nèi)通過抑制p-Akt,進(jìn)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起治療作用。本研究選取阿托伐他汀鈣作為陽(yáng)性對(duì)照組,比較不同濃度的染料木黃酮的體外藥用效果。本研究通過比較不同劑量的染料木黃酮在小鼠體內(nèi)的藥用效果顯示,Akt信號(hào)通路在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,高濃度染料木黃酮可以有效地抑制p-Akt的表達(dá),其抑制效果和阿托伐他汀鈣的小鼠體內(nèi)藥用效果相近。

綜上所述,染料木黃酮在小鼠體內(nèi)通過降低血脂水平,下調(diào)p-Akt的表達(dá),減少血管內(nèi)斑塊的形成,發(fā)揮一定的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。染料木黃酮在防治動(dòng)脈粥樣硬化中具有重要的潛在臨床藥用價(jià)值。