陳彥儒 閆璋哲 譚佳禾 趙 娜 崔偉偉 郝 晶△

(1 山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室； 2 山東師范大學(xué)附屬中學(xué)， 濟(jì)南 250012; 3 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 延安 716000; 4 山東省實(shí)驗(yàn)中學(xué)， 濟(jì)南 250001)

小腸癌是消化系統(tǒng)中較少見(jiàn)的惡性腫瘤,其中以小腸腺癌最多見(jiàn)[1]。近年來(lái)隨著生活水平的提高,小腸癌的發(fā)病率逐漸升高[2]。膽汁酸是膽汁的主要成分,腸道內(nèi)95%以上的膽汁酸經(jīng)頂端鈉離子依賴(lài)性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(apical sodium dependent bile acid transporter, ASBT)介導(dǎo),重吸收進(jìn)入血液循環(huán), 并再次排入腸腔, 此過(guò)程稱(chēng)為腸-肝循環(huán)。編碼人ASBT的基因第10溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族第2成員SLC10A2缺陷可以造成膽汁酸的腸肝循環(huán)中斷。文獻(xiàn)報(bào)道,膽汁酸與消化道腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。Dawson等[5]報(bào)道,ASBT可能通過(guò)調(diào)控膽汁酸腸-肝循環(huán)參與腸道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Raufman等[6]也報(bào)道和野生型小鼠相比,ASBT缺陷小鼠更易誘發(fā)結(jié)腸癌。ASBT是否和小腸癌發(fā)生有關(guān),小腸癌中ASBT表達(dá)情況是否發(fā)生改變,到目前為止未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)ASBT在人正常小腸和小腸癌組織中的表達(dá)情況,為小腸癌的發(fā)生機(jī)制和分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 材料

小腸癌組織及其癌旁組織各10例，主要取自于山東省立醫(yī)院,經(jīng)病理專(zhuān)家診斷為小腸腺癌、小腸黏液腺癌和小腸小細(xì)胞癌及其癌旁正常組織。

1.2 主要試劑

ASBT羊抗人多克隆抗體ab134837購(gòu)自Abcam公司;SABC免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)顯色

所有標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定,石蠟切片厚7μm,經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,3%甲醇H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,水浴鍋內(nèi)96℃～100℃ 30min進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加0.01mol/L pH 7.4的PBS稀釋的SLC10A2一抗(1∶100),4℃孵育過(guò)夜,陰性對(duì)照組以0.01mol/L pH 7.4的PBS代替一抗。滴加0.01mol/L pH 7.4的PBS稀釋的二抗37℃孵育30min,最后室溫下DAB顯色,鏡下控制顯色時(shí)間,至陰性對(duì)照將著色時(shí)為止,蘇木精復(fù)染2min。期間各步均以0.01mol/L pH 7.4的PBS洗滌3次,每次5min。梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。SLC10A2免疫組織化學(xué)顯色陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色,陰性對(duì)照不顯色。

1.4 圖像分析

每張切片選10個(gè)高倍視野,用彩色圖像分析軟件Image-pro Plus 6.0對(duì)染色結(jié)果的平均光密度進(jìn)行半定量分析。

1.5 蛋白印跡檢測(cè)目的蛋白

分別提取人小腸癌及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織總蛋白, 用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后, 用半干式電轉(zhuǎn)的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%的脫脂奶粉封閉1h, 分別加β-actin和ASBT(稀釋濃度均為1∶1000)一抗,濕盒內(nèi) 4℃孵育過(guò)夜, 用含0.5g/L Tween 20的Tris-HCl緩沖液(TBST)洗膜10min×3 次;分別加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1000),室溫孵育1h,加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑于暗室自顯影。用Image J分析軟件測(cè)量膠片上每個(gè)特異條帶的灰度值,并進(jìn)行半定量灰度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ASBT在人小腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示,ASBT在癌旁正常組織中主要表達(dá)于吸收細(xì)胞游離面的細(xì)胞膜;在小腸腺癌中,ASBT在游離面和基底面細(xì)胞膜及細(xì)胞核中都有表達(dá);而在小腸黏液腺癌和小腸小細(xì)胞癌中,ASBT在細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)都有表達(dá),但以細(xì)胞核為主(圖1A～D)。

免疫印跡結(jié)果顯示,和相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織相比,ASBT在小腸黏液腺癌、腺癌和小細(xì)胞癌中表達(dá)均明顯下調(diào)(圖1E)。

分別利用圖像分析軟件Image-pro Plus 6.0和Image J對(duì)免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果和免疫印跡結(jié)果進(jìn)行半定量分析,結(jié)果顯示,和癌旁正常組織相比,ASBT表達(dá)在小腸癌各組的平均密度均下調(diào),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

3 討論

腸道內(nèi)高濃度的次級(jí)膽汁酸對(duì)腸道黏膜的長(zhǎng)期的、反復(fù)的慢性刺激是腸道腫瘤發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。膽汁酸可誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激, 細(xì)胞凋亡和DNA 損傷, 躲過(guò)機(jī)體免疫細(xì)胞進(jìn)行的損傷修復(fù);修復(fù)失敗的細(xì)胞在膽汁酸的反復(fù)刺激下繼續(xù)錯(cuò)配復(fù)制, 導(dǎo)致細(xì)胞突變積蓄,抗凋亡及增殖能力提高, 最終發(fā)生癌變[7-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示腸內(nèi)灌注外源性膽汁酸可使腸道上皮異常增生, 誘發(fā)癌變[9]。除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之外,很多研究者也在研究膽汁酸和人類(lèi)腫瘤之間的關(guān)系。大量文獻(xiàn)報(bào)道膽汁酸與人類(lèi)食管癌[10-12]、胃癌[13]、肝癌[14,15]、膽管癌[16,17]、胰腺癌[18,19]、結(jié)直腸癌[20,21]可能有關(guān)。

鑒于ASBT在膽汁酸腸肝循環(huán)過(guò)程中的重要作用,越來(lái)越多的研究者也開(kāi)始關(guān)注SLC10A2基因和腫瘤發(fā)生的關(guān)系。Dawson等[5]報(bào)道, 與野生型小鼠相比, SLC10A2基因缺陷小鼠糞便膽汁酸含量顯著升高達(dá)10 倍以上, 提示腸道膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可能通過(guò)調(diào)控膽汁酸肝-腸循環(huán)參與到腸道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中。Raufman等[6]比較野生型小鼠和SLC10A2缺陷小鼠偶氮甲烷誘導(dǎo)結(jié)腸癌模型中腫瘤的數(shù)量和體積, 顯示后者較前者明顯增加。

Dvorak等[22]檢測(cè)了ASBT在Barrett食管和食管腺癌中的表達(dá),結(jié)果顯示在Barrett食管活檢組織中有ASBT表達(dá),且在非典型增生性Barrett食管中表達(dá)率較高;隨著異型性增生程度增高,ASBT表達(dá)進(jìn)行性減少;在食管腺癌組織中未檢測(cè)到ASBT的表達(dá)。大量證據(jù)顯示,食管腺癌的發(fā)生是從化生的柱狀上皮到異型性增生再到惡性逐步演變進(jìn)行的,即Barrett食管伴有腸化生的屬于食管腺癌的癌前病變[23]。

本研究檢測(cè)了ASBT在人正常小腸和小腸癌組織中的表達(dá),顯示ASBT在正常小腸組織中主要表達(dá)于吸收細(xì)胞游離面的細(xì)胞膜;和正常小腸相比,ASBT在小腸腺癌、小腸黏液腺癌和小腸小細(xì)胞癌中表達(dá)量下調(diào)且表達(dá)位置發(fā)生了改變,即ASBT不僅表達(dá)于細(xì)胞膜,而且在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá),且在小腸黏液腺癌和小腸小細(xì)胞癌組織中,ASBT主要表達(dá)于細(xì)胞核。在Dvorak等[22]的研究顯示,ASBT在食管腺癌組織中,也表達(dá)于細(xì)胞核,這與本研究結(jié)果是一致的。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和本研究結(jié)果,和正常小腸組織相比,ASBT在小腸癌組織中表達(dá)明顯下調(diào),且出現(xiàn)異位表達(dá),很可能編碼ASBT的基因SLC10A2作為一種新的抑癌基因在小腸癌的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。本研究可以為臨床診斷和治療小腸癌提供新的靶點(diǎn)。

圖1 ASBT在人小腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)