王文秀，彭彥昆*，孫宏偉，魏文松，鄭曉春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心，北京 100083）

生鮮肉作為蛋白質(zhì)的主要來(lái)源，在人們的日常飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)非常重要的地位。2016年我國(guó)肉品的總產(chǎn)量達(dá)8 625萬(wàn) t，整個(gè)肉品行業(yè)發(fā)展?jié)摿薮?。然而，由于肉品本身富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分，容易被其他微生物入侵而發(fā)生系列變化，導(dǎo)致肉的腐敗變質(zhì)，給消費(fèi)者的健康安全造成威脅。因此，對(duì)肉的新鮮度進(jìn)行快速評(píng)價(jià)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

可見-近紅外光譜技術(shù)具有無(wú)損傷、操作簡(jiǎn)單、無(wú)需樣品前處理的優(yōu)點(diǎn)，已被證實(shí)可以對(duì)生鮮肉的品質(zhì)安全參數(shù)進(jìn)行快速分析[1-4]。目前，基于光譜技術(shù)對(duì)肉品新鮮度評(píng)價(jià)可以參照GB 2707—2016《鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》預(yù)測(cè)揮發(fā)性鹽基氮值（total volatile basic nitrogen，TVB-N）評(píng)價(jià)新鮮度。也可借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，直接將光譜信息與新鮮度建立聯(lián)系作出評(píng)價(jià)。馬世榜等[5]利用近紅外光譜結(jié)合支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）對(duì)牛肉的新鮮度進(jìn)行定性判別，驗(yàn)證集正確率為88.89%。蔡健榮等[6]利用近紅外光譜對(duì)豬肉中TVB-N進(jìn)行定量分析，預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)為0.823 8。然而，由于近紅外光譜數(shù)據(jù)量大，光譜信息復(fù)雜且具有多重共線性，因此不少學(xué)者展開特征波長(zhǎng)篩選的研究。如馬世榜[7]、劉飛[8]等利用無(wú)信息變量消除和連續(xù)投影算法提取有效變量，建立了更為簡(jiǎn)化的TVB-N預(yù)測(cè)模型。這些方法大多通過(guò)多次采樣分析，構(gòu)建多個(gè)子模型，通過(guò)評(píng)價(jià)模型誤差確定最優(yōu)變量組合。然而，不同方法篩選的變量個(gè)數(shù)和分布常常有所不同，部分變量缺乏化學(xué)意義上的響應(yīng)機(jī)理解釋，因此變量?jī)?yōu)選仍是目前近紅外光譜分析面臨的重要問題。

二維相關(guān)光譜通過(guò)將光譜信號(hào)擴(kuò)展到第二維上，可以使原來(lái)一維光譜上的弱峰和重疊峰更加清晰，從而提高光譜分辨率。同時(shí)，通過(guò)添加一定的外界擾動(dòng)，對(duì)動(dòng)態(tài)光譜進(jìn)行二維相關(guān)計(jì)算，可以解析光譜細(xì)微特征的變化，尋找與微擾相關(guān)的敏感變量[9-11]。目前，已有學(xué)者將二維相關(guān)光譜應(yīng)用在牛奶摻雜鑒別[12]、食用油摻雜檢測(cè)[13]、中藥摻偽[14]、蛋白飼料原料判別[15]、紅棗營(yíng)養(yǎng)成分變化解析[16]等的研究上，表明通過(guò)分析二維相關(guān)光譜特性，可以觀察到各吸收峰隨外部擾動(dòng)的變化關(guān)系以及對(duì)外部擾動(dòng)的敏感程度。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究，將所有樣品（從新鮮到腐?。┱w作為待研究體系，以TVB-N為外部擾動(dòng)，原始光譜可看作是外擾誘發(fā)的動(dòng)態(tài)光譜。通過(guò)二維光譜計(jì)算，解析同步光譜，觀察外部擾動(dòng)對(duì)不同波長(zhǎng)下動(dòng)態(tài)光譜的影響，可以從機(jī)理上確立與外部擾動(dòng)相關(guān)的敏感波長(zhǎng)。目前將二維相關(guān)近紅外光譜應(yīng)用在生鮮肉新鮮度評(píng)價(jià)的研究尚鮮見報(bào)道。

為探究二維相關(guān)光譜優(yōu)選新鮮度特征變量的可行性，本研究以生鮮豬肉中TVB-N為外界干擾對(duì)光譜進(jìn)行調(diào)制，通過(guò)研究在外部擾動(dòng)存在下體系的變化，解析二維相關(guān)同步光譜和自相關(guān)譜，分析隨外部擾動(dòng)變化的光譜特征信息，確定與TVB-N相關(guān)的特征變量，建立生鮮豬肉的快速判別模型。

1 材料與方法

1.1 材料

冷鮮豬肉背最長(zhǎng)肌購(gòu)買于北京美廉美超市。將其修整為長(zhǎng)×寬×高約8 cm×5 cm×2.5 cm的肉塊，放置在自封袋中運(yùn)輸至無(wú)損檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。將所有樣品按順序編號(hào)后無(wú)積壓放置在4 ℃冰箱中保存，每12 h取出2 個(gè)樣品進(jìn)行光譜采集和理化值測(cè)定，共進(jìn)行15 d，獲得有效樣品58 個(gè)。

1.2 儀器及光譜采集

自行搭建的實(shí)驗(yàn)用可見-近紅外光譜采集系統(tǒng)主要包括鹵鎢燈光源、AvaSpec-2048光譜儀（荷蘭Avantes公司）、光纖、環(huán)形光導(dǎo)、計(jì)算機(jī)等硬件。光譜范圍為350～1 100 nm，分辨率為0.59 nm。采集光譜前，將儀器預(yù)熱約30 min，然后依次采集參比光譜、暗背景光譜以實(shí)現(xiàn)校正，最后采集樣品的光譜信息。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，保證光纖探頭與待測(cè)物距離一致，每個(gè)樣品采集5 個(gè)不同位置處光譜信息并求取平均值，從而減少實(shí)驗(yàn)誤差。光譜數(shù)據(jù)的獲取和保存通過(guò)光譜儀配套軟件Avasoft完成。

1.3 理化指標(biāo)測(cè)定

光譜信息采集完成后，參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的方法對(duì)豬肉樣品中的TVB-N進(jìn)行測(cè)定，并參照文獻(xiàn)[17]將TVB-N小于15 mg/100 g的樣品定義為新鮮肉，將TVB-N介于15～25 mg/100 g之間的樣品定義為次新鮮肉，將TVB-N大于25 mg/100 g的樣品定義為腐敗肉，以此為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)豬肉的新鮮度進(jìn)行劃分。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

首先基于全波段光譜信息建立豬肉新鮮度的判別模型。由于近紅外光譜采集過(guò)程中常常伴隨基線漂移、雜散光等噪音信號(hào)，因此本研究采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normal variate，SNV）、歸一化的預(yù)處理方法來(lái)減少干擾信息，并進(jìn)行分析比較。建模采用了SVM判別分析方法，該方法以結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小化為準(zhǔn)則構(gòu)造決策超平面，使不同種類樣品的間隔最大[18]。

以TVB-N為外部微擾，進(jìn)行二維相關(guān)同步光譜解析，尋找與新鮮度評(píng)價(jià)相關(guān)的特征變量。第1步：根據(jù)TVB-N實(shí)測(cè)值，從最小值和最大值之間以均勻濃度梯度共選取10 個(gè)代表性樣品用于二維相關(guān)光譜分析。第2步：提取光譜特征，本研究采用包絡(luò)線去除方法來(lái)擴(kuò)大較弱的特性信息，同時(shí)壓抑背景光譜[19]。第3步：根據(jù)包絡(luò)線去除后的光譜，選擇不同TVB-N對(duì)應(yīng)光譜具有明顯差異的敏感波段。第4步：對(duì)上述敏感波段分別進(jìn)行二維相關(guān)同步光譜分析，獲取其二維同步光譜及自相關(guān)譜。第5步：通過(guò)解析同步譜和自相關(guān)譜，明確與TVB-N變化密切相關(guān)的特征波長(zhǎng)。

基于所選的特征波長(zhǎng)，分別從原始、經(jīng)SNV預(yù)處理、歸一化預(yù)處理后的光譜中提取相應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)組成新的光譜矩陣，建立優(yōu)化的判別模型。整個(gè)數(shù)據(jù)分析流程圖如圖1所示。上述預(yù)處理和建模過(guò)程在Matlab 2012a平臺(tái)下利用PLS-Toolbox完成，二維光譜解析在薩斯喀徹溫大學(xué)加拿大光源編寫的MIDAS軟件下完成。

圖1 數(shù)據(jù)分析流程圖Fig. 1 Flow chart of data analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)測(cè)定的TVB-N對(duì)58 個(gè)豬肉樣品的新鮮度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共有14 個(gè)新鮮肉、34 個(gè)次新鮮肉以及10 個(gè)腐敗肉。將所有樣品按照3∶1的比例分為校正集和驗(yàn)證集，校正集有43 個(gè)樣品，驗(yàn)證集有15 個(gè)樣品。將3 類樣品分別賦值為1、2、3，各子集樣品的新鮮度情況如表1所示。

表1 3 種新鮮度豬肉的類別賦值及其在校正集和驗(yàn)證集中分布Table 1 Category assignment of three kinds of pork and their distribution in calibration and prediction set

2.2 一維可見-近紅外光譜分析

由于原始光譜信息兩端噪音較大，信噪比低，因此只截取400～1 000 nm波段范圍內(nèi)的光譜用于后續(xù)定性判別分析。從新鮮、次新鮮和腐敗豬肉中各取一個(gè)樣品進(jìn)行光譜信息的對(duì)比分析，其原始一維近紅外光譜如圖2a所示，3 類樣品整體上趨勢(shì)一致，在545～585 nm之間具有明顯差異，該波段范圍與肉中色素的變化有關(guān)[20]。經(jīng)過(guò)SNV和歸一化預(yù)處理后的光譜曲線如圖2b和c所示，2 種預(yù)處理方法均能有效消除基線漂移、光散射等噪音信號(hào)，提高光譜分辨率和靈敏度。

圖2 樣品光譜曲線Fig. 2 Spectral curves of samples

2.3 二維相關(guān)同步光譜分析

為尋找能對(duì)豬肉新鮮度快速評(píng)價(jià)的關(guān)鍵變量，以TVB-N為外部微擾條件，選擇10 條代表性光譜并進(jìn)行包絡(luò)線去除，以增強(qiáng)對(duì)TVB-N變化敏感波段的光譜特征，同時(shí)也增強(qiáng)每條曲線上各個(gè)波段之間光譜信息的對(duì)比性。包絡(luò)線去除前后的光譜曲線對(duì)比如圖3所示，經(jīng)過(guò)包絡(luò)線去除后光譜集中在0～1之間，且在460、590 nm及960 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)明顯的波谷，可見光波段范圍內(nèi)的波谷與肉中肌紅蛋白的濃度和狀態(tài)有關(guān)，960 nm波長(zhǎng)處與N—H鍵的二級(jí)倍頻有關(guān)。在進(jìn)行二維相關(guān)光譜分析之前，為盡可能詳盡的挖掘有效變量，避免微弱的特征信息被隱藏，結(jié)合包絡(luò)線去除后的光譜曲線，將不同TVB-N光譜曲線之間具有差異的波段細(xì)分為7 個(gè)子區(qū)間，分別進(jìn)行二維同步光譜解析。這7 個(gè)子區(qū)間分別為400.1～429.4、430.6～494.8、496.0～550.4、555.1～584.0、585.7～680.3、835.9～954.7、955.8～999.5 nm。

圖3 代表性光譜包絡(luò)線去除前后對(duì)比圖Fig. 3 Comparison of representative spectra before and after continuum removal

對(duì)7 個(gè)子區(qū)間分別進(jìn)行二維光譜分析，其三維投影圖和自相關(guān)譜圖分別如圖4、5所示。三維立體圖形的X軸和Y軸為獨(dú)立的變量軸，一般為波長(zhǎng)或波數(shù)，本研究中的變量為波長(zhǎng)；Z軸為因變量軸，本研究中以相關(guān)強(qiáng)度為Z軸構(gòu)成三維投影圖[21]。同步譜反映了動(dòng)態(tài)光譜信號(hào)隨外部擾動(dòng)發(fā)生變化的協(xié)同程度，它關(guān)于主對(duì)角線對(duì)稱分布，可以從三維同步圖中直觀地觀察到自相關(guān)峰的位置、強(qiáng)度。自相關(guān)峰位于主對(duì)角線上，它的強(qiáng)度反映了該變量處光譜信號(hào)隨外部擾動(dòng)變化的程度[22-28]。結(jié)合自相關(guān)譜圖，在波峰位置處相關(guān)強(qiáng)度大，表明該變量處光譜信號(hào)對(duì)微擾較敏感，即為所要尋找的與新鮮度密切相關(guān)的特征信息。

結(jié)合圖4a、5a，在400.1～429.4 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，主對(duì)角線上411 nm和428 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)微弱的自相關(guān)峰，表明這兩個(gè)波長(zhǎng)下的光譜信號(hào)對(duì)外部微擾敏感，與TVB-N的變化有一定的關(guān)系。根據(jù)Benesch等[29]的研究，415 nm為氧合血紅蛋白的吸收峰，430 nm為脫氧血紅蛋白的吸收峰，本研究中的波長(zhǎng)位置與之稍有偏移，這可能與所用光譜儀器的響應(yīng)有關(guān)。結(jié)合圖4b、5b，在430.6～494.8 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，434、461 nm和490 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)自相關(guān)峰，434 nm為脫氧肌紅蛋白的吸收峰，該處的相關(guān)強(qiáng)度高于461 nm和490 nm，從三維投影圖的顏色參考圖中也可以直觀地看出。結(jié)合圖4c、5c，在496.0～550.4 nm波段范圍內(nèi)，508、521 nm和537 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)自相關(guān)峰，且537 nm處的強(qiáng)度高于前二者，表明該位置處對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)隨TVB-N變化更加明顯。根據(jù)Liu Yang等[30]的研究，505 nm為高鐵肌紅蛋白的吸收峰，535 nm為氧合肌紅蛋白的吸收峰，本研究的特征變量雖稍有偏移，但仍可將其歸屬為二者的吸收峰。結(jié)合圖4d、5d，在555.1～584.0 nm波段范圍內(nèi)，560、569 nm和580 nm處出現(xiàn)自相關(guān)峰，其中580 nm處的強(qiáng)度最高。參考Mancini等[20]研究可知，530～580 nm波段范圍為肌紅蛋白色素的特征波段。結(jié)合圖4e、5e，在585.7～680.3 nm波段范圍內(nèi)，595 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)較強(qiáng)的自相關(guān)峰，在620、630 nm和667 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)3 個(gè)相對(duì)弱的自相關(guān)峰。其中，630 nm為硫化肌紅蛋白的吸收峰，這是由于肉在放置過(guò)程中細(xì)菌產(chǎn)生的H2S氣體與肌紅蛋白結(jié)合，形成了硫化肌紅蛋白。結(jié)合圖4f、5f，在835.9～954.7 nm波段范圍內(nèi)，937 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的自相關(guān)峰，其與C—H鍵的三級(jí)倍頻有關(guān)。結(jié)合圖4g、5g，在955.8～999.5 nm波段范圍內(nèi)，977 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)較弱的自相關(guān)峰，與O—H鍵的一級(jí)倍頻有關(guān)。

圖4 不同波段范圍內(nèi)豬肉樣品的二維相關(guān)同步光譜Fig. 4 2D-correlation spectra of pork samples in different spectral regions

圖5 不同波段范圍內(nèi)的自相關(guān)譜Fig. 5 Autocorrelation spectra in different spectral regions

綜合各個(gè)波段，可以發(fā)現(xiàn)通過(guò)解析二維相關(guān)同步光譜，得到的17 個(gè)特征變量多集中在可見波段。這與肉在貯藏放置過(guò)程中，由于微生物繁殖產(chǎn)生氫過(guò)氧化物，引起肉中色素發(fā)生變化有關(guān)。同時(shí)，由于厭氧菌分解蛋白質(zhì)和氨基酸等產(chǎn)生吲哚、甲胺和H2S等物質(zhì)，脂肪氧化形成硫代巴比妥酸等物質(zhì)，這些均會(huì)促進(jìn)肌紅蛋白的轉(zhuǎn)化和血紅素的氧化[31]。

2.4 定性判別分析模型建立

表2 基于全波段光譜的SVM判別分析模型結(jié)果Table 2 Discrimination results of SVM models based on full-band spectra

首先，基于全波段光譜數(shù)據(jù)建立豬肉新鮮度的SVM判別模型，并比較原始、經(jīng)SNV預(yù)處理和歸一化預(yù)處理光譜的建模效果，如表2所示?？梢娀谶@3 類光譜信息，在校正集中分別有6、4、5 個(gè)樣品誤判，驗(yàn)證集中均有1 個(gè)樣品誤判，且均為腐敗樣品被誤判，總體判別正確率為87.93%、91.38%和89.66%，同時(shí)也可看出預(yù)處理對(duì)模型的效果有所改善，預(yù)測(cè)總體正確率有所提高。

然后，利用解析二維相關(guān)光譜得到的17 個(gè)特征變量，建立優(yōu)化的判別分析模型?；谒x特征波長(zhǎng)，利用原始光譜信息建立的SVM模型，校正集中次新鮮樣品全部判斷正確，新鮮和腐敗樣品各有1和2 個(gè)誤判，驗(yàn)證集樣品全部判斷正確，總體判別正確率為94.83%。利用SNV預(yù)處理后光譜建立的SVM模型，校正集中新鮮和次新鮮樣品全部判斷正確，腐敗樣品有1 個(gè)誤判，驗(yàn)證集樣品全部判斷正確，總體判別正確率為98.28%。利用歸一化預(yù)處理后光譜信息建立的模型效果與SNV預(yù)處理后建模效果一致，總體判別正確率為98.28%，其校正集和驗(yàn)證集樣品判別結(jié)果如圖6所示，可見除第40號(hào)腐敗樣品被誤判為次新鮮外，其余樣品均判斷正確。同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了光譜的預(yù)處理有助于改善模型，提高模型預(yù)測(cè)效果。優(yōu)化后的判別模型，僅利用了總體變量1.61%（原始變量個(gè)數(shù)為1 059）的特征變量，取得了更佳的模型結(jié)果。這表明通過(guò)二維同步光譜分析選出的17 個(gè)變量，能夠反映與豬肉新鮮度密切相關(guān)的特征信息，表征不同TVB-N的光譜變化，簡(jiǎn)化判別模型，縮短運(yùn)算處理時(shí)間。

圖6 基于歸一化預(yù)處理光譜特征變量的判別模型結(jié)果Fig. 6 Discrimination results using feature variables based on spectra after normalization

3 結(jié) 論

以TVB-N為外界干擾，通過(guò)解析二維相關(guān)同步光譜和自相關(guān)譜，共提取到17 個(gè)與新鮮度有關(guān)的特征變量?；谠?、SNV預(yù)處理及歸一化預(yù)處理后的光譜，利用特征波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)光譜建立的SVM模型效果優(yōu)于全波段光譜，總體判別正確率為94.83%、98.28%和98.28%。同時(shí)也說(shuō)明，光譜的預(yù)處理有助于改進(jìn)模型效果?？梢?近紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)分析，可以有效的解析肉在腐敗變質(zhì)過(guò)程中的光譜特征信息變化，確定與新鮮度相關(guān)的敏感變量。該方法簡(jiǎn)單快速，為近紅外光譜特征變量篩選提供了一種新的方法。二維相關(guān)光譜包含信息豐富，選擇的外擾不同得到的譜圖不同，可進(jìn)一步借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)各官能團(tuán)的變化進(jìn)行有效解析，提取特征光譜信息。