王二雷，陳晶晶，劉彥君，劉靜波*

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130062）

花青素作為一種自然界中廣泛存在的水溶性天然色素，安全、無毒，具有多種營養(yǎng)與保健作用，如增強視力、抗炎癥、抗氧化、抗癌、預防心血管疾病等，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領域有著巨大的應用潛力[1-3]。到目前為止，自然界中現已發(fā)現500余種的衍生物，多以糖苷或?；幕ㄉ招问酱嬖赱4]，少以游離花色苷元形式存在?，F已發(fā)現的花色苷元有23 種，而最常見的有6 種，即飛燕草素、矢車菊素、牽?；ㄋ亍⑸炙幧?、天竺葵素、錦葵色素[5]。已有眾多研究報道表明，黃酮苷元的抗氧化活性要強于黃酮苷[6]，花青素作為一種類黃酮類化合物，理論上也應具備此種特點，但受花色苷元存在穩(wěn)定性差、制備工藝不成熟性等因素影響，目前僅有少量關于此方面的報道，如已有研究證實花色苷元（而非糖苷形式）能夠顯著地抑制體內P-糖蛋白表達水平，從而起到治療腫瘤的作用[7]。此外，前期研究也證實了花色苷元粗提物在誘導B16-F0腫瘤細胞凋亡方面明顯強于花色苷形式[8]。為深入探明花色苷元更多潛在功能活性、闡明其化學結構與功效的關系、開發(fā)其多個領域的應用價值，研究花色苷元的制備技術具有重要的意義。

截止到目前為止，國內外已有大量關于花青素分離純化技術方面研究，如大孔樹脂層析技術、高效液相色譜技術、高速逆流色譜技術、膜過濾技術、毛細管電泳技術等[9-11]，但大多局限于花色苷形式，針對花色苷元形式的研究報道則非常少見。由于藍莓果實中不僅花青素含量非常豐富，而且包含5 種最常見的花色苷元單體[12-14]（圖1），因此，本實驗以藍莓果實為原料，采用液液萃取、大孔樹脂層析、固相萃取、高效液相色譜等組合的色譜技術對花色苷元的分離純化技術展開研究，以期為花色苷元的規(guī)?；苽涮峁┬碌臄祿罁蛯嶒灮A。

圖1 藍莓果實中常見的花色苷、花色苷元以及相關化學結構式Fig. 1 Representative anthocyanins and anthocyanidins in blueberries as well as their chemical structures

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生藍莓果實采自于吉林省長白山地區(qū)，果實于-20 ℃條件下冷凍保存，備用。

甲酸、甲醇（均為色譜級） 德國Merck公司；乙醇、乙酸乙酯、鹽酸（均為分析級） 北京化工廠；Amberlite XAD-7HP大孔樹脂（粒徑20～60 目）、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（相對分子質量484.84，純度≥98%）、矢車菊素（相對分子質量322.7，純度≥97%） 美國Sigma公司；Sep-Pak C18固相萃取柱（500 mg） 美國Waters公司。

1.2 儀器與設備

LC-6AD半制備型高效液相色譜儀（配備半制備型C18色譜柱（20.0 mm×250 mm，5 μm）、手動進樣器、5 mL定量環(huán)）、LC-30AD分析型高效液相色譜儀 日本島津公司；2695高效液相色譜-質譜聯用技術儀、Symmetry Shield C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 美國Waters公司；Masslynx軟件（4.1版本）。

1.3 方法

1.3.1 藍莓花色苷粗提物的制備

取1 kg野生藍莓果實置于組織搗碎機中粉碎，用2 L 70%乙醇溶液（含0.1%鹽酸）浸提24 h，在避光、室溫條件進行。將浸提液于3 000 r/min離心5 min，濾液部分進行回收，濾渣進行2 次浸提，合并收集到的濾液，利用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮，溫度50 ℃，濃縮至體積約300 mL。將花色苷濃縮液轉移至分液漏斗，用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，收集水層。取50 mL水層部分上大孔樹脂柱（Amberlite XAD-7HP，2.6 cm×50 cm），先用2 L 0.01%鹽酸溶液進行洗脫，再用500 mL 40%乙醇溶液（含0.01%鹽酸）進行洗脫，收集乙醇洗脫液部分，濃縮，制得藍莓花色苷濃縮液，避光保存、備用。

1.3.2 藍莓花色苷元的酸水解

花色苷在強酸、高溫條件下能夠脫除糖苷，降解成花色苷元形式。花色苷的酸水解方法常用于輔助鑒定天然產物中花色苷的化學結構，但關于花色苷元的制備方面還較少見，本研究中花色苷水解方法建立在文獻[15-16]已有水解方法基礎上，并進行適當的調整。將藍莓花色苷粗提物置于150 mL的帶蓋錐形瓶中，加入50 mL的2.5 mol/L鹽酸溶液，并加入10 mL左右的乙醇用于提高花色苷元產物的溶解度，置于恒溫水浴鍋中，于95 ℃加熱1.5 h，然后迅速冷卻至常溫。將花色苷元水解液進行旋轉蒸發(fā)濃縮處理，除去少量的鹽酸及乙醇，制得藍莓花色苷元粗提液。分別將濃縮前后的花色苷元粗提液用70%乙醇溶液（含3%甲酸）稀釋5 倍，從中取10 μL，過0.22 μm微孔濾膜，利用高效液相色譜法檢測其單體構成。

1.3.3 藍莓花色苷元的固相萃取

首先用3.0 mL乙醇、3.0 mL 0.01%鹽酸溶液沖洗Sep-Pak C18固相萃取柱，完成柱體的活化過程。取1.5 mL藍莓花色苷元粗提液上固相萃取柱，先用6.0 mL的0.01%鹽酸溶液進行洗脫，除去大部分水溶性雜質，再用3 mL 70%乙醇溶液（含0.01%鹽酸）進行洗脫，收集乙醇部分洗脫液。將洗脫液在不超過50 ℃條件下進行旋轉蒸發(fā)濃縮，再進行真空冷凍干燥，制得藍莓花色苷元提取物粉末。將一定量花色苷元提取物用70%乙醇溶液（含3%甲酸）溶解，從中取10 μL，過0.22 μm微孔濾膜后，利用高效液相色譜法檢測其單體構成及純度。

1.3.4 高純度藍莓花色苷元的制備

經固相萃取后，花色苷元提取物為幾種花色苷元單體混合物的形式，普通的色譜純化手段難以達到分離單體的目的，本實驗采用半制備型高效液相色譜技術進行花色苷元單體的分離。半制備高效液相色譜的操作參數基于分析型高效液相色譜條件，并進行適當的調整。所用流動相構成為色譜級甲醇（A相）及3%甲酸溶液（B相），梯度洗脫程序：0 min，85% B；0～3 min，85%～80% B；3～10 min，80%～75% B；10～55 min，75%～30% B；55～60 min，30% B；60～65 min，30%～85% B；65～110 min，85% B。檢測波長530 nm，流速2 mL/min，進樣量5 mL。用3%甲酸溶液溶解藍莓花色苷元提取物，配制成2 mg/mL的溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾后上樣。根據每一種花色苷元單體在色譜圖上的出峰時間，收集洗脫液，多次進樣后，收集足量的花色苷元單體洗脫液。為進一步提高花色苷元單體的純度，將花色苷元單體洗脫液再次進樣，收集單體峰對應的洗脫液，濃縮、干燥，制得不同花色苷元單體。取1 mg花色苷元單體樣品，用3%甲酸溶液配制成0.1 mg/mL的檢測液，過0.22 μm微孔濾膜后，利用高效液相色譜法檢測其單體構成及純度。

1.3.5 花色苷元的高效液相色譜分析

花色苷元粗提物及單體樣品中的苷元種類及結構需要借助分析型高效液相色譜手段進行檢測。高效液相色譜的運行參數建立在實驗室之前對藍莓花色苷研究基礎上[17]，并略有所調整。流動相由A相（色譜級甲醇）和B相（3%甲酸溶液）組成。梯度洗脫度程序：0 min，85% B；0～5 min，85% B；5～10 min，85%～80% B；10～22 min，80%～75% B；22～32 min，75% B；32～39 min，75%～30% B；39～45 min，30% B；45～55 min，30%～85% B；55～60 min，85% B。檢測波長530 nm，流速0.5 mL/min，進樣體積10 μL。由于大部分的花色苷元單體在可見光區(qū)擁有近似的最大吸收峰，則樣品中總花色苷元的含量均可折合成矢車菊素標準品的等價物。通過配制1～200 μg/mL的矢車菊素標準品梯度溶液，以不同質量濃度梯度標準品溶液色譜峰的峰面積為縱坐標，以質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，再通過代入樣品中花色苷元總峰面積計算其質量濃度，進而得出其含量或純度。

1.3.6 花色苷元的質譜分析

花色苷元樣品溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，采用高效液相色譜-質譜聯用技術進一步明確花色苷元的化學結構[18]，采用矢車菊素苷元標準品進行儀器操作參數的優(yōu)化及樣品中苷元的定性分析。高效液相色譜部分的運行條件借鑒1.3.5節(jié)中的參數條件，但又有所區(qū)別，如其中流動相中B相的組成為0.5%甲酸溶液，其目的是為了提高碎片離子的電離度。質譜部分的主要參數條件：離子源為正離子模式，毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓10.0 V，錐孔氣流量80 L/h，離子源溫度110 ℃，脫溶劑化溫度380 ℃，脫溶劑化流速600 L/h，離子掃描范圍為m/z 200～1 000。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 藍莓花色苷粗提物的純化結果

圖2 花色苷標準品及藍莓花色苷樣品的高效液相色譜檢測結果Fig. 2 HPLC profiles of anthocyanin standard and blueberry anthocyanin-rich extracts

野生藍莓果實中除含花色苷類物質外，還含有大量的糖類、有機酸類、果膠、弱極性的黃酮類物質[19]，這些雜質的存在會影響花色苷的純度，必須通過純化手段去除。未經純化的藍莓花色苷提取液的高效液相色譜分析結果如圖2所示，每種花色苷的名稱已在前期研究工作中進行了報道[20]，所有花色苷單體的鑒定均基于其紫外-可見光譜特征、高效液相色譜中與標準品所對應的保留時間、高效液相色譜-質譜聯用技術中的碎片離子的質荷比（m/z），以及已有文獻[21]的相關報道。藍莓果實中至少包括16 種糖基化形式的花色苷單體（圖2C），且均由5 種基本的苷元（飛燕草素、矢車菊素、牽?；ㄋ亍⑸炙幧睾湾\葵色素）和4 種糖苷組成（半乳糖苷、葡萄糖苷、阿拉伯糖苷及木糖苷）組成。大體上，飛燕草素、錦葵色素和芍藥色素為藍莓果實中含量最豐富的3 種苷元形式，而矢車菊素和芍藥色素則相對含量較少。圖2B及2C分別比較了4 h和24 h時的提取結果，短時間（4 h）的提取并不能使聚合狀態(tài)的花色苷轉化成游離形式，延長提取時間（24 h）則能實現花色苷單體的分離，從而更好地發(fā)揮藍莓果實的營養(yǎng)價值及潛在的健康益處[22]。

花色苷的純化主要通過乙酸乙酯萃取及大孔樹脂純化實現[23]。在乙酸乙酯萃取階段，大部分弱極性的黃酮可留在乙酸乙酯層，在水層與乙酸乙酯層之間會聚集一定量的果膠類物質，通過萃取手段能有效地去除這兩部分雜質。在大孔樹脂的水洗脫階段，花色苷粗提物中水溶性還原糖類、蛋白類、有機酸類等都能被洗脫下來，在40%乙醇溶液的洗脫階段，大部分的花色苷類都能被洗脫下來，但柱體中仍然殘留少量的弱極性黃酮類物質，這部分雜質雖然不會對已經洗脫出來的花色苷造成影響，但會對再次上樣的花色苷的純化產生影響，因此，本實驗采用80%～100%乙醇溶液洗脫出這部分殘留的黃酮類物質。通過比較純化前（圖2B）與純化后（圖2E）的花色苷單體構成得出，僅有少量花色苷單體的峰面積比例產生了波動（表1），說明此階段的純化過程未破壞果實中花色苷的原有構成。通過對比純化前（圖2D）與純化后（圖2F）花色苷樣品（360 nm）中黃酮類雜質的變化情況得出，經過純化的花色苷提取物中已經不含有黃酮類雜質。以上結果表明，乙酸乙酯萃取及Amberlite XAD-7HP大孔樹脂層析步驟能有效分離藍莓花色苷樣品。

表1 藍莓花色苷提取物大孔樹脂純化前與純化后的高效液相色譜鑒定結果（530 nm）Table 1 Anthocyanins identified by HPLC-DAD at 530 nm in crude and purified extracts

2.2 藍莓花色苷元提取物的純化結果

采用強酸水解花色苷，能夠使花色苷的苷元部分與糖苷部分分離，從而釋放出花色苷元。由于花色苷的種類繁多，導致其結構鑒定過程較為繁瑣，而經過酸水解制備出的花色苷元種類非常有限，通過早期對花色苷元種類的鑒定能夠大大簡化花色苷的鑒定過程。常見的花色苷元有6 種，分別為飛燕草素、矢車菊素、牽?；ㄋ?、芍藥色素、天竺葵素、錦葵色素[24-25]。因此，酸水解方法常用于天然產物中花色苷種類的初步鑒定，到目前為止，國內外除將酸水解方法用于輔助鑒定花色苷種類的報道外，開展花色苷元分離純化方面的研究報道并不多見，本研究在酸水解工藝的基礎上，開展花色苷元的深入純化工作?；ㄉ赵獦藴势肥杠嚲账氐囊合嗌V檢測結果見圖3A，其保留時間為40.7 min。藍莓花色苷酸水解液的液相圖譜如圖3B所示，共得到5 個色譜峰。通過比較5 個色譜峰對應的紫外-可見光譜曲線（圖4）可知，5 種單體在280 nm及530 nm波長均有最大吸收峰，與花青素類化合物特征圖譜相吻合[26]，說明這5 種單體均屬于花青素類物質。通過對比標準品保留時間（40.7 min）及前期已有的藍莓花色苷元方面的研究報道[27]，圖3B中5 種單體分別對應飛燕草素、矢車菊素、牽?；ㄋ亍⑸炙幧丶板\葵色素。通過對比5 種單體在色譜圖上的峰面積比例（圖5）得出，3 種主要的單體（飛燕草素、牽?；ㄋ丶板\葵色素）占總花色苷元構成的83.8%，這3 種單體可作為后期分離純化的重點。此外，由圖3B可知，藍莓中16 種花色苷均已經徹底轉化成苷元形式，表明當前水解條件的可操作性較強。

圖3 花色苷元標準品及藍莓樣品的高效液相色譜檢測結果（530 nm）Fig. 3 HPLC profiles of anthocyanidin standard and blueberry anthocyanidin-rich extracts at 530 nm

圖4 花色苷元標準品及藍莓花色苷酸水解后得到的5 種單體的紫外-可見光譜圖Fig. 4 UV-visible spectra of mixed anthocyanidin standards and five anthocyanidins from acid hydrolysis of blueberry anthocyanin extract

藍莓花色苷的酸水解過程不僅產生了花色苷元，而且引入了其他雜質，如生成的還原糖類、鹽酸殘留物及其他反應副產物。為除去這些雜質，本實驗先后采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮步驟及固相萃取步驟。旋轉蒸發(fā)過程既能濃縮花色苷元溶液，又能導致部分鹽酸的揮發(fā)，從而制得較純的花色苷元濃縮液（圖3C）。固相萃取技術為一種快速脫除樣品中雜質的前處理方法[28-29]，本實驗中采用C18固相萃取小柱進行花色苷元的除雜操作[30]?；ㄉ赵獫饪s液上樣后，采用0.01%鹽酸溶液能夠有效地脫除苷元樣品中殘留的還原糖類及其他水溶性雜質，花色苷元則通過70%乙醇溶液（含0.01%鹽酸）洗脫下來，苷元洗脫液的液相圖譜如圖3D所示，通過比較酸水解后、濃縮后及經固相萃取柱純化后的花色苷元構成（圖5）得出，此純化過程對花色苷元的整體構成影響不大，僅飛燕草素及錦葵色素的比例構成略有變化。將收集到的花色苷元洗脫液濃縮、冷凍干燥后，采用高效液相色譜法，在530 nm波長處對花色苷元的純度進行分析，測得其純度為70.2%。鑒于大孔樹脂Amberlite XAD-7HP與固相萃取柱C18同屬于柱色譜分離范疇，后期比較2 種柱色譜分離花色苷元的差異得出，大孔樹脂的載樣量大、分離時間長，而固相萃取柱載樣量小、分離時間短，從整體上來說，固相萃取更簡單、高效，能在數分鐘內達到純化花色苷元的目的。

圖5 不同藍莓花色苷元樣品中5 種單體的高效液相色譜中峰面積比例結果Fig. 5 Comparison of HPLC-DAD peak area ratios between five anthocyanidin monomers in different blueberry anthocyanidin samples

2.3 藍莓花色苷元的單體制備結果

大孔樹脂層析及固相萃取技術能使花色苷元與其他雜質得到很好的分離，但卻不能使不同花色苷元單體間分離，這是由于花色苷元單體間的化學結構及極性非常相似[31]。通過比較藍莓花色苷元5 種單體在液相色譜圖上的差別（圖3D）可知，除芍藥色素與錦葵色素保留時間相近外，其他3 種花色苷元均有較好的分離度，因此，本實驗進一步采用半制備型高效液相色譜分離花色苷元單體[32-33]。半制備液相色譜參數在分析型液相色譜參數基礎上進行適當調整，優(yōu)化了梯度洗脫程序、總運行時間、流速等參數。將經過固相萃取的花色苷元樣品進行半制備液相色譜分離后，所得結果如圖6A0所示，在68～80 min內共得到4 種花色苷元組分，每種色譜峰均出現了平頂現象，這是由于色譜柱載樣量過高所導致，但并不影響不同苷元單體間的分離與洗脫液的收集。在制備花色苷元單體的過程中發(fā)現，花色苷元單體的純度越高，其化學結構受周圍環(huán)境的影響越敏感，推測其出現化學構型發(fā)生了轉變或降解，此部分實驗內容尚需后續(xù)深入研究加以證實。因此選擇適宜的花色苷元單體制備條件非常關鍵，如操作過程中需要全程控制在低pH值、低溫、避光環(huán)境等條件下進行。

圖6 藍莓花色苷元提取物的半制備級和分析級高效液相色譜的分離結果（530 nm）Fig. 6 Semi-preparative and analytical HPLC profiles of fractions 1 to 4 of blueberry anthocyanidin extract at 530 nm

為提高花色苷元的純度，將每種花色苷元單體的洗脫液進行再次進樣（圖6B0～6E0），將收集到的4 種苷元組分洗脫液濃縮、凍干，再用分析型高效液相色譜（圖6B1～6E1）及高效液相色譜-質譜聯用技術檢測單體的種類及純度（圖7）。經鑒定，采用半制備液相色譜分離后，所得組分一為飛燕草素，對應圖6B1中36.2 min色譜峰及圖7A中質譜離子[M＋]（m/z）303.2；組分二為矢車菊素，對應圖6C1中40.7 min色譜峰及圖7B中質譜離子[M＋]（m/z）287.2；組分三為牽牛花素，對應圖6D1中色譜峰（40.7 min及圖7C中質譜離子[M＋]（m/z）317.2；組分四由芍藥色素及錦葵色素兩種單體成分構成，其中芍藥色素對應圖6E1中色譜峰43.2 min及圖7D中質譜離子[M＋]（m/z）301.3，錦葵色素對應圖6E1中色譜峰43.5 min及圖7D中質譜離子[M＋]（m/z）331.2。經過濃縮、凍干處理后，最終從1 kg藍莓果實原料中制得飛燕草素單體24.2 mg（純度98.2%）、矢車菊素單體6.6 mg（純度96.3%）、牽牛花素單體8.9 mg（純度92.6%）、錦葵色素單體17.4 mg（純度90.5%）。鑒于本實驗所制得的花色苷元純度均高于90%，且制備過程中所用的試劑均屬常規(guī)材料，所用純化技術以常用色譜手段為主，所用工藝參數較為溫和，由此表明，當前的苷元單體制備方法具備較高的可行性，能夠為花色苷元產品的規(guī)?；a提供一定的參考依據。

圖7 半制備高效液相色譜制得的4 種藍莓花色苷元組分的質譜檢測結果Fig. 7 Mass spectra of four blueberry anthocyanidin fractions from semi-preparative HPLC

3 結 論

以長白山野生藍莓果實為原料，運用組合色譜手段進行花色苷元的制備技術研究。首先運用液液萃取及Amberlite XAD-7HP大孔樹脂層析技術分離出藍莓花色苷粗提液，再利用酸水解技術制得藍莓花色苷元水解液，經旋轉蒸發(fā)濃縮后，運用固相萃取技術制得純度為70.2%的藍莓花色苷元提取物。采用半制備型高效液相色譜技術從藍莓花色苷元提取物中成功分離得到4 種純度為90%～99%的花色苷元單體。本研究中制備花色苷元的工藝可操作性強，能夠為花色苷元的規(guī)?；a提供一定的參考依據。考慮到花色苷元今后的應用領域主要在功能食品、藥品、化妝品等領域，花色苷元的生產成本、產品得率、溶劑殘留、安全性等方面的要求，本研究還需進一步優(yōu)化工藝方法，以便拓寬花色苷元的應用領域，發(fā)揮其最大應用價值。