高乾坤，焦琳舒，杜賀超，陸兆新，別小妹，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

帶魚（Trichiurus haumela）是我國的主要海洋經(jīng)濟魚種之一，其廣泛分布于我國沿海各省并以東海產(chǎn)量最高，其味道鮮美，營養(yǎng)價值高，具有很高的經(jīng)濟效益。帶魚中富含不飽和脂肪酸，相比于家禽肉類，如牛肉、豬肉和雞肉等，更易被人體吸收[1]。但同樣因為其較高的脂肪酸含量比例，使其相較于其他家禽肉類更易氧化、腐敗變質(zhì)。另外，帶魚屬于深海魚種，生活在深水區(qū)，當被捕撈上岸之后便會死亡，不能像淡水魚一樣在捕撈、運輸甚至銷售過程中一直保持鮮活。因此，帶魚的防腐保鮮對于其發(fā)揮更大的經(jīng)濟效益，便成為一個至關重要的問題[2-3]。

帶魚的腐敗，主要是由于腐敗微生物引起的。魚體是一個優(yōu)良的天然“培養(yǎng)基”，富含各種營養(yǎng)基質(zhì)，微生物會在魚體快速繁殖生長，逐漸引起腐敗。對這些致腐微生物的研究，是防腐的首要關鍵[4]。常用的腐敗菌分析方法有傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)分離、熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）與變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）等方法[5-8]，但是由于細菌之間的相互作用復雜，部分微生物培養(yǎng)條件困難，傳統(tǒng)方法無法準確分離鑒定樣品腐敗期間細菌群落組成。有研究者將傳統(tǒng)分離方法與16S rRNA分子鑒定技術相結(jié)合，對帶魚冷藏過程中的主要腐敗微生物進行分離與快速鑒定發(fā)現(xiàn)，帶魚的主要優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），但由于傳統(tǒng)分離檢測方法的局限性，仍無法對帶魚冷藏過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化進行全面分析[9-11]。

近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，高通量測序技術應運而生。作為一種無需微生物分離培養(yǎng)的快速檢測技術，高通量測序技術不僅可以檢出難以培養(yǎng)的優(yōu)勢微生物，還能確定樣品中大多數(shù)微生物的相對豐度[9]。因此，高通量測序技術已廣泛應用于水土環(huán)境檢測[12-13]、人體腸道微生物檢測[14-16]、食品生產(chǎn)加工[17-19]等多方面。在扇貝柱[20]等水產(chǎn)品中微生物多樣性分析上，高通量測序技術也是一種有效手段。

為了系統(tǒng)地研究不同產(chǎn)地帶魚從新鮮狀態(tài)到腐敗階段的整個過程菌相的動態(tài)變化情況，更全面地了解帶魚貯藏過程中菌群變化規(guī)律，本實驗以產(chǎn)自江蘇南通呂四港黃海海域和浙江舟山港東海海域的帶魚為研究對象，采用Illumina Miseq高通量測序技術分析不同冷藏時間下的帶魚樣品中的菌群組成情況及變化規(guī)律，為帶魚的防腐保鮮提供理論依據(jù)，也為開發(fā)水產(chǎn)品微生物快速鑒定方法以保障帶魚質(zhì)量安全提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶魚（200～250 g），當日早晨捕撈于江蘇南通呂四港、浙江舟山港口，冰運至實驗室。產(chǎn)自江蘇南通的樣品編號為HH，產(chǎn)自浙江舟山的樣品編號為DH。經(jīng)保鮮袋密封包裝后放置于4 ℃冰箱冷藏。以購買當天帶魚作為對照組，記為0 d，其余為實驗組，分別冷藏2、4、6、8 d。

細菌基因組DNA提取試劑盒 美國Omega公司；Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設備

5084R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；PTC-100TM PCR儀 美國MJ Research公司；拍擊式均質(zhì)機法國Interscience公司。

1.3 方法

1.3.1 提取DNA的樣品處理

在無菌超凈工作臺中，將帶魚去頭去尾去內(nèi)臟，割取不同部位魚肉組織，剪成塊狀。為保證采集樣品的代表性，隨機選取3 條帶魚樣品進行混合。稱取25 g魚肉組織，置于無菌均質(zhì)袋中，加入50 mL含0.1 g/100 mL蛋白胨的0.85 g/100 mL的生理鹽水，均質(zhì)10 min。經(jīng)200 目無菌紗布過濾后，濾液1 000 r/min離心10 min，去沉淀，上清液于10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀重懸浮于1 mL TE buffer，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總DNA的提取

按照Omega公司細菌基因組DNA提取試劑盒的方法操作，提取細菌總DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.3.3 PCR擴增及高通量測序

以提取的總細菌基因組DNA為模板，引物針對16S rRNA基因V3/V4區(qū)合成特異引物，利用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物進行PCR擴增。擴增后的PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)純化后的樣品進行定量檢測。將檢測后的樣品委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，進行高通量測序。

對MiSeq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)進行處理，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接（merge）成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向[21]。

基于操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析結(jié)果，研究環(huán)境中微生物的多樣性，通過單樣本的多樣性（Alpha多樣性）分析微生物群落的豐度和多樣性，以及對測序深度進行檢測[22]?；诜诸悓W信息，在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計，綜合討論不同產(chǎn)地帶魚冷藏的微生物群落。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與OUT分析

圖1 樣品序列長度分布圖Fig. 1 Length distribution profile of trimed sequences

采用Illumina Miseq高通量測序獲得了江蘇南通及浙江舟山兩種產(chǎn)地帶魚樣品的原始序列數(shù)據(jù)后，經(jīng)Trimmomatic及FLASH軟件優(yōu)化數(shù)據(jù)后得到了10 個樣本共388 229 條有效序列，序列平均長度為445.98～449.89 bp，主要集中在441～460 bp的區(qū)間長度內(nèi)（圖1）。隨著樣品量的不斷增大，在樣品量大于20 000時，OUT曲線（圖2A）和Shannon-Wiener曲線趨于平坦（圖2B），說明測序數(shù)據(jù)量合理，且測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息[23]。

圖2 稀釋曲線（A）和 Shannon-Wiener曲線（B）分析Fig. 2 Rarefaction curves (A) and Shannon-Wiener curves (B)

對樣品進行OUT聚類分析，獲得了OUT數(shù)量為209 個，涵蓋了14 門，24 綱，46 目，78 科，129 屬。產(chǎn)自江蘇南通及浙江舟山的新鮮帶魚樣品的OUT數(shù)量分別為183和146（表1），帶魚樣品在經(jīng)8 d冷藏后，OUT數(shù)量分別下降至68與78，即在冷藏期間，樣品中的微生物種類在不斷減少，尤其是在冷藏后期4～8 d時，OUT數(shù)量急速減少，可能是冷藏后期腐敗程度較高，多種微生物無法生存導致。

表1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Statistical results of sequence data

2.2 Alpha多樣性分析

根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標的Shannon、Simpson、ACE、Chao1及Coverage指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。由表2可知， 各樣品的Coverage都達到了0.999以上，即樣品文庫覆蓋率高，序列未被檢出的可能性較小，可用于樣品細菌多樣性分析。產(chǎn)地為江蘇南通呂四港的帶魚樣品的ACE、Chao1及Shannon指數(shù)在冷藏第4天時達到最高，Simpson值最低，這說明該產(chǎn)地帶魚在冷藏4 d后物種豐富度達到最高，可能由于此時帶魚中營養(yǎng)物質(zhì)最為豐富，細菌生長迅速。而浙江舟山產(chǎn)地的帶魚樣品的ACE、Chao1及Shannon指數(shù)在冷藏2 d時達到最高，冷藏6 d時，ACE、Chao1及Shannon指數(shù)略有回升，這現(xiàn)象可能是由腐敗菌的大量增加造成的。冷藏8 d時，兩種產(chǎn)地來源的帶魚樣品的ACE、Chao1及Shannon指數(shù)均達到其最小值，Simpson值則剛好相反，這說明了在冷藏8 d后，帶魚樣品中的細菌豐度及多樣性最低。

表2 Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index

2.3 不同產(chǎn)地帶魚冷藏過程中細菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 基于門水平的細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

圖3 基于門分類水平上的樣品菌群分布圖Fig. 3 Bacterial distribution pattern at the phylum level

兩種產(chǎn)地帶魚樣本序列經(jīng)RDP classifier軟件進行分類分析，在門水平上，其樣本群落組成如圖3所示。產(chǎn)自江蘇南通呂四港的新鮮帶魚樣品總細菌組成主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）及擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，相對豐度分別為53.06%、12.64%、24.29%及7.51%，還包括少量的梭桿菌門（Fusobacteria）及放線菌門（Actinobacteria）。而產(chǎn)自浙江舟山港的新鮮帶魚樣品總細菌組成主要以變形菌門與厚壁菌門為主，占據(jù)菌群總量的94.98%，余下5.02%為異常球菌-棲熱菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門與極少量的其他門類。

在兩種產(chǎn)地的帶魚樣品整個冷藏過程期間，變形菌門始終占據(jù)優(yōu)勢，相對豐度為49.72%～98.84%，尤其是在冷藏后期，樣品HH8與DH8中，變形菌門相對豐度皆在94%以上。其次是厚壁菌門，在江蘇南通呂四港產(chǎn)地的帶魚樣品中，第6天時，厚壁菌門相對豐度達到最高為38.39%，說明隨著冷藏時間延長，厚壁菌門對帶魚的腐敗變質(zhì)起了越來越大的影響，其影響程度僅次于變形菌門。在兩種產(chǎn)地的帶魚樣品中，冷藏第2天，擬桿菌門的相對豐度皆有所增加，在樣品HH2與DH2中產(chǎn)自最高可達到16.90%與15.01%，且隨著冷藏時間的延長，擬桿菌門所占比例逐漸下降，直至冷藏第8天相對豐度已不足1%，說明擬桿菌門在帶魚腐敗變質(zhì)中并不是主要成因。

另外，兩種不同產(chǎn)地帶魚樣品之間菌落結(jié)構(gòu)的主要差異為異常球菌-棲熱菌門。產(chǎn)自浙江舟山港的帶魚樣品在冷藏第0、2、6天時檢出異常球菌-棲熱菌門，其相對豐度分別為1.76%、11.61%和1.03%，而產(chǎn)自江蘇南通呂四港的帶魚樣品在冷藏0～4 d時都能檢出異常球菌-棲熱菌門，新鮮樣品中相對豐度最高達到了24.29%。

2.3.2 基于屬水平的細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

在屬水平上，兩種不同產(chǎn)地的帶魚樣品在冷藏期間共分離得到了129 屬，圖4為相對豐度大于1%的菌群柱狀分布圖。嗜冷菌屬（Psychrobacter）一直占據(jù)優(yōu)勢，在兩種帶魚冷藏期間豐度呈上升趨勢，冷藏8 d后，在江蘇南通及浙江舟山產(chǎn)地帶魚樣品中，嗜冷菌屬微生物相對豐度分別達到了微生物總量的65.69%和55.88%，在帶魚腐敗變質(zhì)中起重要作用?，F(xiàn)有研究報道，嗜冷菌屬是低溫冷藏食品的優(yōu)勢腐敗菌，在牛奶、冷鮮肉及需冷藏海產(chǎn)品中都十分常見[24-26]。次要優(yōu)勢菌屬為Oceanisphaera，此菌屬首次報道于2003年，是分離自海底淤泥中的較為新型的菌屬[27]。近年來相關多集中于該菌屬新菌種的發(fā)現(xiàn)[28-29]，鮮見有研究發(fā)現(xiàn)其在水產(chǎn)品腐敗中的作用。而通過高通量測序技術檢測出Oceanisphaera是帶魚腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗菌屬，這一研究結(jié)果說明，高通量測序技術可直接對待測樣品中全部基因序列進行檢測，可檢測出無法培養(yǎng)的或較為新型的腐敗菌，與傳統(tǒng)分離檢測技術相比更加快速全面。

圖4 基于屬分類水平上的樣品菌群分布圖Fig. 4 Bacterial distribution pattern at the genus level

此外，兩種產(chǎn)地帶魚在冷藏期間微生物多樣性與豐度有明顯差異。產(chǎn)自江蘇南通呂四港的帶魚樣品在冷藏期間以嗜冷菌屬、棲熱菌屬（Thermus）、Oceanisphaera、肉桿菌屬（Carnobacterium）、漫游球菌屬（Vagococcus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）為主。新鮮帶魚樣品中，棲熱菌屬與假交替單胞菌所占比例僅次于嗜冷菌屬，相對豐度分別為24.29%和17.96%。冷藏第2天后，假交替單胞菌相對豐度驟降至2.54%。冷藏第6天時，肉桿菌屬與漫游球菌屬含量明顯增加，相對豐度分別達到16.08%與15.09%。這兩屬在進化關系上十分相近，是水產(chǎn)品的重要致病菌、腐敗菌[30-31]。冷藏第8天時，相對豐度大于10%的僅有嗜冷菌屬及Oceanisphaera兩菌屬，且此時微生物豐度及多樣性達到最低值，即帶魚樣品中的營養(yǎng)物質(zhì)被極大的消耗，多數(shù)微生物已無法生存。

而產(chǎn)自浙江舟山港的帶魚樣品在冷藏期間以嗜冷菌屬、希瓦氏菌屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Oceanisphaera、黃桿菌屬、臺灣溫單胞菌屬（Tepidimonas）、漫游球菌屬、米勒氏菌屬（Moellerella）為主。新鮮帶魚樣品中，嗜冷菌屬、希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、漫游球菌屬、米勒氏菌屬、丹毒桿茵屬（Erysipelothrix）、摩根菌屬（Morganella）7 種菌屬的相對豐度相差不大，均為10%左右。其中米勒氏菌屬占最大比例為15.07%。冷藏2 d時，優(yōu)勢微生物種類有較大改變，黃桿菌屬、臺灣溫單胞菌屬、棲熱菌屬豐度提升，皆超出總微生物的10%。冷藏4～8 d時，嗜冷菌屬、希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、Oceanisphaera占絕對優(yōu)勢，帶魚腐敗已基本結(jié)束，菌群組成變化較小，這4 類菌屬在其腐敗過程中起到了不容忽視的作用。藍蔚青等[9,32]通過PCR-DGGE技術研究冷藏過程中帶魚的菌相變化時發(fā)現(xiàn)，嗜冷桿菌在前期亦是帶魚的優(yōu)勢腐敗菌，與本研究結(jié)果不同的是，到腐敗后期，希瓦氏菌屬和弧菌屬取代了嗜冷桿菌，占據(jù)優(yōu)勢地位。

此外，優(yōu)勢菌的比例與細菌總量呈正相關，在一定程度上反映樣品在貯藏過程中腐敗變質(zhì)的情況。之前的實驗結(jié)果顯示，帶魚在4 ℃的貯藏過程中，菌落總數(shù)保持增長趨勢。江蘇南通呂四港的帶魚在貯藏2 d時，菌落總數(shù)已接近國標限量6（lg（CFU/g）），浙江舟山的帶魚在貯藏4 d時，也超過了這一限量。高通量測序的結(jié)果顯示，江蘇南通和浙江舟山的帶魚樣品主要腐敗菌嗜冷桿菌、Oceanisphaera和希瓦氏菌等也分別在第2天和第4天時呈現(xiàn)出上升趨勢。第8天時，兩個產(chǎn)地的樣品優(yōu)勢腐敗菌相對豐度超過89%，細菌總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量都遠超過了國標限量，帶魚嚴重腐敗。說明這些優(yōu)勢菌與帶魚的腐敗密切相關。

綜上所述，帶魚在冷藏期間微生物群落以嗜冷菌屬為主，兩種不同產(chǎn)地的新鮮帶魚樣品及冷藏前期的菌相差異較大，隨著冷藏時間的延長，兩者都以嗜冷菌屬及Oceanisphaera為優(yōu)勢菌屬，這與帶魚的深海生存環(huán)境及冷凍保藏的常規(guī)運輸方式有十分重要的關系。

2.4 不同產(chǎn)地帶魚冷藏時細菌群落的主成分分析（principal component analysis，PCA）

如圖5所示，橫坐標為PC1，其貢獻率為41.81%?？v坐標為PC2，貢獻率為25.07%。這兩個主成分是樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異的主要因子。在PC1方向上，產(chǎn)自江蘇南通呂四港的帶魚樣品在冷藏不同時間的樣本點分布差異十分顯著，新鮮帶魚樣本點與冷藏8 d的帶魚樣本點處于PC1水平的兩個極端，且冷藏2～6 d樣本點分布于X軸中間，說明不同冷藏時間在PC1水平上對樣品菌群結(jié)構(gòu)變化影響顯著；在PC2水平上，兩種產(chǎn)地的樣品點分布區(qū)域十分明顯，江蘇南通呂四港產(chǎn)地樣本點基本上分布于Y軸的下方，浙江舟山產(chǎn)地樣本點分布于Y軸的上方，即PC2是解釋兩種產(chǎn)地樣品菌群結(jié)構(gòu)變化的主要成分。

圖5 樣品PCAFig. 5 PCA scatter plot of PC1 vs. PC2 for bacterial communities

3 結(jié) 論

本研究以不同產(chǎn)地的帶魚為研究對象，采用Illumina Miseq高通量測序技術分析不同冷藏時期帶魚樣品中菌群組成及變化情況。結(jié)果表明，兩種產(chǎn)地帶魚在新鮮狀態(tài)時菌相差異較大：產(chǎn)自江蘇南通呂四港的新鮮帶魚樣品以嗜冷菌屬、棲熱菌屬與假交替單胞菌為主，相對豐度分別為23.25%、24.29%和17.96%；產(chǎn)自浙江舟山港的新鮮帶魚樣品中菌群組成較為豐富，嗜冷菌屬、希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、漫游球菌屬、米勒氏菌屬、丹毒桿茵屬、摩根菌屬7 種菌屬的相對豐度相差不大，均為10%左右。說明產(chǎn)地的區(qū)別是造成菌群組成有明顯差異的主要原因。隨著4 ℃貯藏時間的延長，帶魚腐敗程度加劇，兩個產(chǎn)地的帶魚菌種多樣性都開始下降，由于氧氣含量、溫度、競爭等因素，優(yōu)勢菌數(shù)量逐漸增加變得顯著，說明優(yōu)勢菌與帶魚的腐敗有密切關系。并且兩個產(chǎn)地的菌群組成愈發(fā)相近，都以嗜冷菌屬與Oceanisphaera為優(yōu)勢腐敗菌。其中嗜冷菌屬作為主要優(yōu)勢腐敗菌在帶魚腐敗過程中起重要作用，而Oceanisphaera為帶魚腐敗中的次要優(yōu)勢腐敗菌，目前有關Oceanisphaera在水產(chǎn)品腐敗中的研究尚鮮見報道。由此可見，相對于傳統(tǒng)的分離鑒定方法，高通量測序技術在檢測新型腐敗菌時更具優(yōu)勢。高通量測序技術檢測不同產(chǎn)地帶魚冷藏過程中微生物多樣性的變化，不僅可以分析不同產(chǎn)地帶魚樣品中微生物多樣性的差異，更可以高效快速地分析帶魚腐敗過程中的優(yōu)勢腐敗菌，為今后帶魚質(zhì)量安全監(jiān)測及靶向研究帶魚防腐保鮮技術提供理論依據(jù)。