張大力，馮艷鶴，劉炳利，潘 聰，封 玲，鄭明珠*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

糯玉米起源于中國(guó)，其含有人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)成分，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為10.6%，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%～75%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～5.5%，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.6%。又因其分子質(zhì)量比普通玉米小10 倍多，食用消化率高出20%。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化率都超過(guò)玉米，所以以糯玉米為主的糯性谷物食品已成為當(dāng)下餐桌熱點(diǎn)[1]。我國(guó)北方冬天具有特色的傳統(tǒng)食品之一的黏豆包正是以糯玉米粉為主要原料，通過(guò)自然發(fā)酵的方式制作而成的冷凍食品[2]。但糯玉米碴自然發(fā)酵周期長(zhǎng)、微生物菌群復(fù)雜，在自然發(fā)酵過(guò)程中可能存在腐敗菌甚至致病菌污染的情況，發(fā)酵過(guò)程受很多因素影響。

發(fā)酵是微生物活動(dòng)的一種體現(xiàn)，自然發(fā)酵過(guò)程中環(huán)境條件、地域差異的不同，對(duì)產(chǎn)品的安全、質(zhì)構(gòu)、色澤、風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用[3-4]。利用微生物發(fā)酵技術(shù)調(diào)控和提升產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵在于要了解自然發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)，高通量測(cè)序方法不僅不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，就能夠檢測(cè)到較低豐度的微生物，還能更加全面而準(zhǔn)確地展示樣品微生物的群落結(jié)構(gòu)[5-6]。

因此，本研究擬對(duì)自然發(fā)酵糯玉米碴中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，揭示其中的優(yōu)勢(shì)菌群，然后對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分離鑒定，獲得優(yōu)勢(shì)菌株后進(jìn)行糯玉米粉的微生物改性處理，比較純種發(fā)酵和自然發(fā)酵對(duì)糯玉米粉加工特性的影響。為今后工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定、健康安全的發(fā)酵糯玉米粉為主要原料的產(chǎn)品提供基本理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯玉米碴由小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室提供。

MRS培養(yǎng)基 美國(guó)BD公司；新型微生物微量生化鑒定管 青島賓得生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA Ki美國(guó)Omega公司；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Life Tech公司；Ep0406 Taq DNA Polymerase 美國(guó)Thermo Fisher公司；Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒美國(guó)Beckman公司；溶菌酶、蛋白酶K、酚-氯仿-異戊醇溶液、氯仿-異戊醇溶液、Tris、乙二胺四乙酸二鈉、TE緩沖液、十二烷基硫酸鈉、NaCl、瓊脂糖 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；GL-88B旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；Allegra X-30型離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Eppendorf公司；RVA-TecMasterTM型快速黏度分析儀 澳大利亞Perten公司；TA-XT plus物性測(cè)定儀 英國(guó)Stable Micro System公司；Phenom pro型掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom-world公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將糯玉米碴用滅菌的蒸餾水浸泡，使蒸餾水沒(méi)過(guò)樣品，室溫浸泡96 h后取4 mL液體樣品，分多次加入滅菌的2 mL離心管中，10 000×g離心3 min，棄置上層液體，將離心管倒置直至沒(méi)有液體流出。

1.3.2 DNA的提取與PCR擴(kuò)增

根據(jù)CTAB法進(jìn)行總DNA的快速提取[7]，以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA V3～V4區(qū)引物，341F引物：5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3’、（barcode）5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，805R引物：5’-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATT CCA-3’、5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。PCR體系：2×Taq Master Mix 15 μL；Bar-PCR Primer F（10 μmol/L）1 μL；Primer R（10 μmol/L）1 μL；Genomic DNA 10～20 ng；H2O 30 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5 個(gè)循環(huán)，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 15 μL；Primer F（10 μmol/L）1 μL；Primer R（10 μmol/L）1 μL；Genomic DNA 20 ng， H2O 30 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 發(fā)酵液中細(xì)菌多樣性分析

自然發(fā)酵糯玉米碴中細(xì)菌多樣性分析采用MiSeq技術(shù)[8-13]，測(cè)序由上海生工生物有限公司完成。

1.3.4 發(fā)酵液中乳酸菌分離、純化與初步篩選

乳酸菌的分離采用稀釋涂布平板法：取1 mL發(fā)酵菌懸液，置于9 mL滅菌生理鹽水中，混勻后取1 mL加入另一管9 mL滅菌生理鹽水中，以此類推，將發(fā)酵液稀釋至原液的10-9[14]。取各稀釋度的菌懸液各1 mL分別涂布于平板中，乳酸菌的純化采用劃線分離法：選取在MRS瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并產(chǎn)溶鈣圈的單菌落，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h后。選取產(chǎn)溶鈣圈的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色及過(guò)氧化氫酶檢測(cè)[15]，符合革蘭氏染色陽(yáng)性且過(guò)氧化氫酶陰性特征即可以初步確定為乳酸菌。

1.3.5 乳酸菌的復(fù)篩與16S rDNA鑒定

復(fù)篩通過(guò)菌株的產(chǎn)酸能力、繁殖能力進(jìn)行篩選[16]。確定一株產(chǎn)酸能力最快、繁殖能力最佳的菌株命名為FL-0616。將篩選得到的FL-0616菌株提取DNA經(jīng)測(cè)序鑒定。采用SK8255（細(xì)菌）基因組提取試劑盒提取FL-0616菌株的基因組DNA[17]，以該DNA為模板，27F引物：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；1492R引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。分別為正向和反向引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]，反應(yīng)體系見(jiàn)1.3.2節(jié)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。將測(cè)序基因序列通過(guò)NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)（http:∥www.ncbi.nlm1nih.gov /Blast.cgi/）進(jìn)行序列同源性分析，采用鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并通過(guò)1 000 次自舉分析（Boostrap）進(jìn)行置信度檢測(cè)。

1.3.6 純菌種發(fā)酵、自然發(fā)酵、未發(fā)酵樣品的預(yù)處理

乳酸菌懸液的配制：將鑒定后的乳酸菌進(jìn)行活化增殖培養(yǎng)，接種于MRS液體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，直到乳酸菌濃度達(dá)到5.21×108CFU/mL。

純菌種發(fā)酵：加入已滅菌的蒸餾水，糯玉米碴與蒸餾水的比例為1∶3（g/mL）裝入1 000 mL錐形瓶中，將其混勻后加入分離得到的發(fā)酵乳桿菌菌懸液，菌懸液的接種量為體積分?jǐn)?shù)5%，接種后置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵48 h。自然發(fā)酵：菌懸液用蒸餾水代替，其他條件與純種發(fā)酵一致。未發(fā)酵：取純種發(fā)酵質(zhì)量相同的糯玉米碴置于37 ℃培養(yǎng)箱中，從烘箱中取出3 種狀態(tài)下的糯玉米碴用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)進(jìn)行干磨制粉，磨粉后的糯玉米粉過(guò)80 目篩保存，樣品預(yù)處理完成。

1.3.7 糊化特性的測(cè)定

向快速黏度分析儀測(cè)量筒中加入25 mL水，分別取3 種方式下的糯玉米粉3.00 g，用攪拌槳攪動(dòng)20 s，攪拌均勻即可開(kāi)始測(cè)量。在測(cè)量時(shí)起始溫度設(shè)定為50 ℃，維持1 min；在3.9 min內(nèi)升溫至96 ℃；保持2 min；然后在3.5 min內(nèi)降溫至50 ℃，并保持1.5 min[19]。

1.3.8 熟面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定樣品質(zhì)構(gòu)，取3 種方式下的糯玉米粉20 g，加入80%的蒸溜水分別制成厚度約為0.5 cm生面團(tuán)，蒸熟后進(jìn)行測(cè)定。物性儀選用的探頭為P/36R，測(cè)定的條件為[20]：測(cè)量前速率1.00 mm/s；測(cè)量速率2.00 mm/s；測(cè)量后速率2.00 mm/s；壓縮率50.00%；壓縮程度70%；兩次壓縮間隔5 s；強(qiáng)制觸發(fā)力5.0 g，觸發(fā)距離2.00 mm。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

樣品黏在樣品臺(tái)上，經(jīng)真空噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察并采集圖像（×5 000）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液中細(xì)菌多樣性分析

圖1 細(xì)菌多樣性Fig. 1 Bacterial diversity of fermentation broth

如圖1所示，自然發(fā)酵的菌液中菌群組成為：乳桿菌屬（Lactobacillus）65.14%、腸桿菌屬（Enterobacter）23.85%、魏斯氏菌屬（Weissella）7.09%、明串珠菌屬（Leuconostoc）0.9%、未分類（unclassified）0.96%、克雷伯菌屬（Klebsiella）0.45%、微小桿菌屬（Exiguobacterium）0.42%、勒克菌屬（Leclercia）0.23%、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）0.19%、腸球菌屬（Enterococcus）0.14%、銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas）0.14%、泛菌屬（Pantoera）0.14%、葡萄球菌屬（Staphylococcus）0.14%。研究結(jié)果表明，乳桿菌屬是自然發(fā)酵菌液中的優(yōu)勢(shì)菌屬。

2.2 乳酸菌的生理生化及16S rDNA分析

2.2.1 細(xì)菌生理生化鑒定

圖2 分離株（A）及其革蘭氏染色（B）（×400）Fig. 2 Isolates (A) and Gram staining (B) (× 400)

如圖2所示，菌落顏色為乳白色、凸起不透明、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、無(wú)芽孢桿狀、直徑在1.0～2.0 mm、革蘭氏染色呈陽(yáng)性，排列方式為單個(gè)或多個(gè)短鏈。

2.2.2 菌株液體培養(yǎng)基的最終pH值與生長(zhǎng)量測(cè)定結(jié)果

圖3 各菌株培養(yǎng)過(guò)程中菌液pH值與菌株生長(zhǎng)量的變化Fig. 3 Change in pH value and growth rate of six selected isolates

對(duì)篩選得到的6株符合革蘭氏染色陽(yáng)性過(guò)氧化氫酶陰性的菌株測(cè)定其pH值和生長(zhǎng)曲線。由圖3可知，菌株的pH值在24 h內(nèi)下降均比較明顯，菌體生長(zhǎng)速率在18 h左右達(dá)到最大值。但菌株FL-0616的pH值最低3.87，OD600nm為2.155，更加適合做發(fā)酵劑，因此對(duì)其進(jìn)行16S rDNA鑒定。

表1 FL-0616細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification of FL-0616

由表1可知，經(jīng)過(guò)篩選得到的菌株FL-0616能夠發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖及阿拉伯糖，對(duì)果糖與麥芽糖呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。在明膠液化、V-P實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、硝酸酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、硫化氫等實(shí)驗(yàn)中均呈陰性反應(yīng)。通過(guò)參照文獻(xiàn)[21-22]初步認(rèn)定菌株FL-0616為發(fā)酵乳桿菌。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

圖4 菌株FL-0616片段DNA的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 4 PCR amplification of DNA fragment from strain FL-0616

如圖4所示，菌株FL-0616擴(kuò)增產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為1 435 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。根據(jù)FL-0616的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上Lactobacillus fermentum（MF3551691.1）、L. ingluviei（AB911500.1）、L. equigenerosi（NR041566.1）等不同種乳桿菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，圖5結(jié)果顯示FL-0616與發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）自然聚為一支，且自展值為100，綜合形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征及分子生物學(xué)序列分析，最終確定菌株FL-0616為發(fā)酵乳桿菌。

圖5 FL-0616系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree of FL-0616

2.3 糊化特性分析

表2 不同發(fā)酵方式糯玉米粉糊化特性Table 2 Pasting characteristics of waxy corn flour fermented with different strains

由表2可見(jiàn)，兩種方式均可顯著提高糯玉米粉的峰值黏度，自然發(fā)酵和純菌種發(fā)酵分別提高1 480 cP和1 565 cP。峰值黏度反映淀粉顆粒的膨脹性能，而影響淀粉膨脹性能的因素為支鏈淀粉的分子結(jié)構(gòu)、淀粉的親水性，乳酸菌純菌種發(fā)酵使支鏈淀粉的含量降低，而中間及短鏈的支鏈淀粉含量相對(duì)增加，且發(fā)酵使蛋白質(zhì)、脂肪明顯減少，淀粉顆粒在糊化的過(guò)程中更易吸水膨脹至更大的體積，故峰值黏度增加[23]。自然發(fā)酵和純菌種發(fā)酵對(duì)糯玉米粉的衰減值分別顯著提高了834 cP和864 cP，衰減值可以評(píng)價(jià)淀粉熱糊的穩(wěn)定性，衰減值越大，表明淀粉顆粒越不穩(wěn)定，其顆粒內(nèi)部分子間結(jié)合力減弱，這使得顆粒更容易在剪切作用下發(fā)生破裂和瓦解[24]。自然發(fā)酵和純菌種發(fā)酵對(duì)糯玉米粉的回生值分別顯著降低了132 cP和195 cP，回生值可以評(píng)價(jià)淀粉的抗老化性能，回生值小，抗老化性能提高[25]。由于糯玉米的胚乳中100%的淀粉是支鏈淀粉，支鏈淀粉的平均外支鏈長(zhǎng)度對(duì)糯玉米粉回生速率有重要影響，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，支鏈淀粉的分支被適度降解，使回生速率降低[26-28]。綜上所述，純菌種發(fā)酵和自然發(fā)酵都能夠?qū)ε从衩追燮鸬揭欢ǖ母男宰饔?。與自然發(fā)酵相比，乳酸菌發(fā)酵顯著提高糯玉米粉峰值黏度，降低回生值，改性效果較好。

2.4 質(zhì)構(gòu)特性分析

表3 不同發(fā)酵方式糯玉米粉質(zhì)構(gòu)特性Table 3 Texture characteristics of waxy corn flour fermented with different strains

自然發(fā)酵和乳酸菌純菌種發(fā)酵對(duì)糯玉米粉的硬度、黏附性、膠著性等質(zhì)構(gòu)特性均產(chǎn)生了明顯的影響。由表3可知，乳酸菌純菌種發(fā)酵將糯玉米粉的硬度提高1 070 g，而自然發(fā)酵可提高275 g。硬度是描述與食品變形或穿透產(chǎn)品所需的力有關(guān)機(jī)械質(zhì)地特性，是食品保持形狀的內(nèi)部結(jié)合力[29]，發(fā)酵能夠提高糯玉米粉熟面團(tuán)的硬度可能是由于自然發(fā)酵液中乳酸菌生長(zhǎng)代謝利用了糯玉米粉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降低蛋白含量并促進(jìn)支鏈淀粉短鏈的水解從而導(dǎo)致淀粉凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)加強(qiáng)[30]。乳酸菌發(fā)酵將糯玉米粉的黏附性提高332、膠著性提高600，黏附性和膠著性的增大表明面團(tuán)更有韌性，在一定程度上補(bǔ)充了糯玉米粉類食品相對(duì)缺乏黏彈性的缺點(diǎn)。咀嚼性在數(shù)值上等于硬度、彈性、內(nèi)聚性的乘積，原則上咀嚼性的變化受到3個(gè)因素的影響，但表中彈性和內(nèi)聚性差異不顯著，因此咀嚼性與硬度呈正相關(guān)。純菌種發(fā)酵改性的糯玉米粉熟面團(tuán)的膠著性和咀嚼性顯著（P＜0.05）高于未發(fā)酵及自然發(fā)酵。乳酸菌對(duì)糯玉米粉起到改性作用可能是因?yàn)榕从衩椎矸壑泻欣谌樗峋L(zhǎng)代謝的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，乳酸菌代謝產(chǎn)生的二氧化碳增多致使糯玉米粉熟面團(tuán)彈性和回復(fù)性的增加[31]，人工添加的乳酸菌含量要比自然發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸菌含量多，因此改性效果優(yōu)于自然發(fā)酵。

2.5 未發(fā)酵、自然發(fā)酵、純種發(fā)酵掃描電子顯微鏡結(jié)果分析

圖6 發(fā)酵前后掃描電子顯微鏡圖片（×5 000）Fig. 6 Scanning electron microscope pictures of waxy corn flour before and after fermentation (× 5 000)

由圖6可見(jiàn)，發(fā)酵前后糯玉米粉的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。原糯玉米粉微觀結(jié)構(gòu)較為完整，自然發(fā)酵對(duì)糯玉米粉的侵蝕效果較輕，而純菌種發(fā)酵對(duì)其結(jié)構(gòu)的破壞程度較自然發(fā)酵要更加明顯。自然發(fā)酵和純種發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌利用了糯玉米粉里淀粉、蛋白質(zhì)及脂肪等物質(zhì)，生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)酸產(chǎn)酶影響其分子結(jié)構(gòu)對(duì)糯玉米粉起到了改性的作用。

3 結(jié) 論

本研究采用MiSeq技術(shù)對(duì)自然發(fā)酵菌液中細(xì)菌

16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，分析結(jié)果顯示自然發(fā)酵糯玉米碴中的細(xì)菌以乳桿菌屬為主，占65.14%，與其他人研究相符。通過(guò)稀釋涂布平板篩選出1株產(chǎn)酸能力最快、繁殖能力最佳的菌株進(jìn)行鑒定，經(jīng)測(cè)序比對(duì)鑒定其為發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum），同時(shí)符合細(xì)菌多樣性分析結(jié)果。通過(guò)對(duì)糊化特性和質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定，結(jié)果證明純種發(fā)酵會(huì)顯著提高峰值黏度、谷值黏度和最終黏度，顯著降低回生值；蒸制前后對(duì)比顯著增加硬度、黏附性、膠著性和咀嚼性從而改善糯玉米粉的粉質(zhì)特性。為制作一種以發(fā)酵糯玉米粉為主要原料的食品且能夠縮短自然發(fā)酵周期的發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。此研究?jī)H證明了乳酸菌發(fā)酵對(duì)糯玉米粉及糯玉米熟面團(tuán)的改性作用，而對(duì)自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌對(duì)其加工特性的影響、以及發(fā)酵后糯玉米的熟面團(tuán)進(jìn)一步應(yīng)用還有待研究。