蘇曉珊 張怡 王子英 羅又才 劉香易 馬永篤 鐘紅梅 李蒙 嚴(yán)亨秀△

(1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省康復(fù)醫(yī)院急診科，四川 成都 610041)

多發(fā)性硬化癥(Multiplcsclcrosis，MS)是一種常見的自身免疫性疾病，其病因復(fù)雜，主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)白質(zhì)炎性脫髓鞘[1,2]，發(fā)病時具有癥狀和體征的空間多發(fā)性以及病程的時間多發(fā)性等特點[3]。盡管人們多年來對多發(fā)性硬化癥進行了深入的研究，但對其病因及發(fā)病機制仍未完全清楚。目前，實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是國際公認(rèn)的多發(fā)性硬化癥的理想模型[4-6]，在臨床神經(jīng)免疫學(xué)的研究中具有重要意義。盡管國內(nèi)外建立自身免疫性腦脊髓炎模型的方法很多[8]，但髓鞘少突細(xì)胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)是唯一能引起脫髓鞘抗體反應(yīng)以及T細(xì)胞反應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘蛋白成分[9]，因此，MOG35-55免疫誘導(dǎo)的自身免疫性腦脊髓炎模型與多發(fā)性硬化癥非常相似，故本文以此模型進行研究。

趨化因子是一組對白細(xì)胞有趨化作用的細(xì)胞因子，其主要功能是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10]，在多發(fā)性硬化癥的發(fā)生、進展中，具有重要的介導(dǎo)作用。CCL2屬于CC趨化因子亞族，同免疫細(xì)胞共同參與CNS中炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，通過激活單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞活性而在先天免疫中起關(guān)鍵作用[11-16]。研究表明，CCL2在獲得性免疫中對T淋巴細(xì)胞分化具有顯著的調(diào)節(jié)作用，但對多發(fā)性硬化癥的作用機制還不清楚。本研究利用CCL2基因敲除小鼠，研究CCL2趨化因子對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中CD4 +，CD8 + T淋巴細(xì)胞的作用，以期進一步探究CCL2對自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病機制的影響及作用通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級6周齡C57BL/6小鼠，購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司；CCL2-/-基因敲除小鼠由四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室饋贈，雌雄各半，體重為18～20 g。小鼠飼養(yǎng)于四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室SPF級動物中心，室內(nèi)溫度控制在22℃～26℃，濕度50%～60%，明暗循環(huán)12 h/d，自由飲食和飲水。

1.1.2 主要試劑

鼠源MOG35-55多肽(Genemed Synthesis Inc，美國)；完全福氏佐劑(Chondrex，美國)；百日咳毒素(List Biological Laboratories，美國)；HE染料(北京中杉金橋公司，中國)；BSA(Servicebio，中國)；CD4(Servicebio，中國)；CD8(Servicebio，中國)；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(Servicebio，中國)；組化試劑盒DAB顯色劑(北京中杉金橋公司，中國)；4%多聚甲醛(PFA)(成都科龍化工試劑廠，中國)；0.1M PBS(北京中杉金橋公司，中國)；Taq Mastermix(天根生物，中國)；動物組織基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，中國)；引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 自身免疫性腦脊髓炎模型的建立

參照Nabeela Nathoo等的建模方法，隨機選取6周齡C57BL/6小鼠30只，雌雄各半，CCL2-/-模型組、C57BL/6模型組和C57BL/6非模型組各10只。將3mg·ml-1MOG35-55與完全弗氏佐劑：CFA按1:1混合為抗原佐劑，在第0 d和第7 d時于小鼠背部脊柱雙側(cè)分四點皮下注射0.2 ml·只；并于第1 d和第8 d時向小鼠腹腔注射0.005 mg·ml-1百日咳毒素，0.1 ml·只；C57BL/6非模型組注射等量生理鹽水。

1.2.2 發(fā)病小鼠神經(jīng)功能評價

每天觀察小鼠狀態(tài)并稱重記錄，根據(jù)小鼠發(fā)病癥狀進行神經(jīng)功能評分。將正常小鼠與EAE模型小鼠置于同一平臺上，觀察其尾部是否翹立；行動、攀爬時，小鼠軀體是否左右側(cè)傾或打轉(zhuǎn)等。

動物發(fā)病癥狀體征分級標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Konot[16]分為五級，1分：動物尾部無力；2分：動物尾部無力，且前肢或后肢中等無力；3分：前肢或后肢嚴(yán)重?zé)o力，人為翻身后不能恢復(fù)；4分：瀕死狀態(tài)；5分：死亡。

1.2.3 HE染色

第24 d時小鼠腹腔注射10%水合氯醛3 ml·kg-1，心臟灌注后采集小鼠脊髓組織腰膨大段樣本于4%多聚甲醛固定。隨后將樣本進行石蠟包埋和組織切片[19]，HE染色后在光鏡下觀察組織中炎性細(xì)胞浸潤改變。

1.2.4 石蠟切片免疫組織化學(xué)檢測

將制備的脊髓組織石蠟切片進行脫蠟至水：二甲苯Ⅰ15 min-二甲苯Ⅱ15 min-二甲苯III 15min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min-蒸餾水洗；脫蠟至水后進行抗原修復(fù)：置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(PH6.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)，中火8 min至沸，保溫再轉(zhuǎn)中低火7 min，自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，并加3%BSA封閉；隨后，分別加一抗：CD4、CD8于4°C孵育過夜，二抗：PBS洗滌一抗后滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫孵育55 min；最后，使用DAB顯色液顯色并在終止顯色后用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核3 min；脫水封片：切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。統(tǒng)計小鼠脊髓組織中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的含量變化。并在100倍鏡下對5個視野的陽性細(xì)胞計數(shù)取平均值進行統(tǒng)計。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件，進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)，以P<0.05為差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCL2基因敲除鼠基因型鑒定

利用PCR和瓊脂糖凝膠電泳鑒定其基因型。突變型基因片段長度是179 bp，野生型基因片段長度是287 bp，雜合型基因片段長度是179 bp～287 bp。圖1是基因鑒定的部分結(jié)果。

2.2 小鼠發(fā)病率比較

模型組CCL2-/-小鼠對EAE具有一定抗性，除一只小鼠出現(xiàn)了輕微癥狀外，其余小鼠都未發(fā)??；而對照組C57BL/6小鼠的EAE發(fā)病率為100%，且癥狀表現(xiàn)非常嚴(yán)重，二者差異顯著。

模型組C57BL/6小鼠從免疫后第14d開始發(fā)病，平均發(fā)病時間為免疫后第(14.2±1.9)天，在發(fā)病后(5.1±0.3)天時達(dá)到疾病高峰(圖2)。

圖2 模型組C57BL/6、CCL2-/-鼠與非模型組C57BL/6的神經(jīng)功能評分比較

2.3 小鼠神經(jīng)功能評分

根據(jù)Konot[16]神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)對實驗小鼠進行評價，CCL2-/-模型組小鼠中僅1只小鼠于免疫后第21d發(fā)病，出現(xiàn)輕微拖尾現(xiàn)象，2d后(第23天)恢復(fù)正常，結(jié)果見表1。

表1 第21天小鼠神經(jīng)功能評分(x±s，n=10)

注：與非模型組(C57BL/6)和模型組(C57BL/6)相比，*p<0.05。

2.4 小鼠脊髓組織學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，相較于空白組，自身免疫性腦脊髓炎模型組中C57BL/6小鼠脊髓腰膨大段組織均出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤；而CCL2-/-小鼠脊髓腰膨大端段組織中出現(xiàn)炎性細(xì)胞的數(shù)量明顯輕于C57BL/6小鼠。未注射MOG抗原的空白組C57BL/6小鼠脊髓未見異常(圖3)。

圖3 小鼠脊髓組織HE染色結(jié)果

2.5 小鼠脊髓組織中CD4+和CD8+ T細(xì)胞改變

C57BL/6組CD4+T細(xì)胞顯著高于空白組(P<0.05)，而CCL2-/-小鼠脊髓組織中CD4+T細(xì)胞明顯低于C57BL/6模型組(P<0.05)(圖4)。C57BL/6組CD8+細(xì)胞表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.05)，CCL2-/-小鼠脊髓CD8+T細(xì)胞顯著低于C57BL/6模型組(P<0.05)，而與空白組無顯著性差異(圖5，表2)。

圖4 小鼠脊髓CD4+T淋巴細(xì)胞

圖5 小鼠脊髓CD8+T淋巴細(xì)胞

分組非模型組(C57BL/6)模型組(C57BL/6)模型組(CCL2-/-)CD4+29.60±9.44152.00±19.63*35.00±10.83CD8+103.00±4.56210.2 0±7.96*109.00±6.16

注：與非模型組(C57BL/6)和模型組(CCL2-/-)相比，*p<0.05。

3 討論

多發(fā)性硬化癥(MS)/實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病。目前，有大量研究探討了實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)的發(fā)病機制，但中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)途徑及淋巴液、腦脊液循環(huán)路徑等研究尚不明確，所以其確切病因還不清楚[20]。

有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫監(jiān)視異常與多發(fā)性硬化癥(MS)/實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)等自身免疫性疾病密切相關(guān)[21]。多發(fā)性硬化癥(MS)、實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫性炎性脫髓鞘疾病，多種淋巴細(xì)胞參與其脊髓損傷炎性反應(yīng)中，而參與炎性反應(yīng)的淋巴細(xì)胞的激活與分化和多種趨化因子有關(guān)[22,23]。

趨化因子具有白細(xì)胞趨化性，有報道指出，在神經(jīng)細(xì)胞(如：小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等)受病理刺激后將誘導(dǎo)產(chǎn)生大量趨化因子[24]。CCL2屬于趨化因子CC型家族，也稱之為單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)，對單核細(xì)胞向炎性區(qū)域的招募具有特異性等[25]，且CCL2趨化因子在獲得性免疫中對T淋巴細(xì)胞分化有調(diào)節(jié)作用[26]。目前，趨化因子與神經(jīng)炎性反應(yīng)的研究對于CCL2/CCR2介導(dǎo)神經(jīng)元間信號傳遞的機理分子機理還知之甚少，CCL2在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)中的作用是否通過調(diào)控T淋巴細(xì)胞的分化而改變了中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴循環(huán)的研究也存在空白。本研究利用CCL2基因敲除鼠，研究實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)在沒有CCL2存在的情況下是否被髓鞘少突細(xì)胞糖蛋白MOG誘發(fā)，研究結(jié)果表明CCL2-/-敲除小鼠幾乎不能誘導(dǎo)出腦脊髓炎，提示CCL2在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)發(fā)病中具有一定抑制作用。進一步對炎性細(xì)胞進行分析，發(fā)現(xiàn)CCL2-/-小鼠脊髓中的CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞均顯著下降，提示CCL2的缺乏可能導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞減少，從而抑制究實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)生發(fā)展。研究結(jié)果也再次證明了CCL2趨化因子通過對炎性細(xì)胞浸潤的改變和對T淋巴細(xì)胞分化的影響，將進一步調(diào)控抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)生發(fā)展。

多發(fā)性硬化癥(MS)/實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)的病因雖尚不清楚，通過研究炎癥細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)與趨化因子(如CCL2)、黏附分子間協(xié)同作用[26]，以及同腦膜淋巴管間關(guān)系，或可為發(fā)現(xiàn)MS/EAE發(fā)病機制提供新的方向。