戴作波,姜志戎
江蘇省寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,江蘇寶應(yīng), 225800
麝香接骨丸是該院自行研制的純中藥制劑,由紅花、血竭、麝香、丁香、骨碎補、自然銅、當(dāng)歸、杜仲等十五味中藥組成。有和營活血接骨續(xù)筋功效。用于跌打損傷所致軟組織損傷、骨折脫位中后期筋肉攣痛見上述癥候者。
Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀,Waters 2998型PDA檢測器(美國Waters公司)。METTLER TOLEDO MS-105DU型電子分析天平(0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多公司)。KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。Milli-Q DIRECT8型純水儀(美國Millipore公司)。
麝香接骨丸(批號:170612,170626,170701,由本院提供),羥基紅花黃色素A對照品(批號:111637-201609,純度91.9%,購自于中國食品藥品研究檢定院)。甲醇(色譜純,美國TEDIA公司),磷酸(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。
色譜柱:Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-0.7%磷酸溶液(30:70);流速:1.0 mL/min;檢測波長:403 nm;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。
該方中紅花為飲片粉末入藥,因此在考察提取條件時參考2015年版《中國藥典》“紅花”項下的有關(guān)內(nèi)容:取本品粉末(過三號篩)約0.4 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入25%甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率 300 W,頻率 50 kHz)40 min[1],放冷,再稱定重量,用25%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
據(jù)此考察了甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇和水為提取溶劑,30 min、40 min、50 min 和 60 min 為提取時間[2],對制劑中羥基紅花黃色素A提取得率的影響。
表1 提取條件考察
由此可知,以25%甲醇為提取溶劑,超聲處理40 min,效果較好,見表 1。
精密稱取羥基紅花黃色素A對照品2.782 mg,置10 mL量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得對照品貯備液。精密量取對照品貯備液4 mL,置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得6#對照品溶液;精密量取對照品貯備液2 mL,置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得5#對照品溶液;精密量取對照品貯備液1 mL,置10 mL量瓶中[3],加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得4#對照品溶液;精密量取對照品貯備液0.5 mL,置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得3#對照品溶液;精密量取3#對照品溶液5 mL,置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻[4],即得2#對照品溶液;精密量取2#對照品溶液5 mL,置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得1#對照品溶液。精密吸取上述溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定,記錄峰面積。每份溶液平行進樣2次,求平均峰面積。以平均峰面積為縱坐標(Y),對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(X),進行線性回歸[5]。
表2 標準曲線
羥基紅花黃色素A的回歸方程為Y=259 81 X-205 03(r=0.999 7),線性范圍為 3.20~102.27 μg/mL,見表2。
以S/N≈10為標準,羥基紅花黃色素A的定量限為 1.60 μg/mL;以 S/N≈2~3 為標準,羥基紅花黃色素A的檢測限為0.40 μg/mL。
取批號為170626的本品6份,研細,每份取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入25%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)40 min,放冷,再稱定重量[6],用 25%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。精密吸取上述溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定,記錄峰面積。每份溶液平行進樣2次,求平均峰面積。以平均峰面積照標準對照法計算含量[7]。
見表3表4。
表3 標準對照
表4 重復(fù)性試驗
取“重復(fù)性試驗”中第1份供試品溶液為研究對象。精密吸取該溶液10μL,注入液相色譜儀,測定,記錄峰面積。連續(xù)進樣6次,計算平均峰面積和RSD,見表5。
表5 精密度試驗
取“重復(fù)性試驗”中第1份供試品溶液為研究對象。精密吸取該溶液10 μL,注入液相色譜儀,測定,記錄峰面積。間隔若干時間進樣1次,計算平均峰面積和RSD,見表6。
表6 穩(wěn)定性試驗
取批號為170 626的該品6份,研細,每份取約0.25 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入羥基紅花黃色素 A 對照品溶液(265.59 μg/mL)1 μL 和 25%甲醇 24 μL,密塞,稱定重量[8],超聲處理(功率 250 W,頻率50 kHz)40 min,放冷,再稱定重量,用25%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。精密吸取上述溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定,記錄峰面積。每份溶液平行進樣2次,求平均峰面積。以平均峰面積照標準對照法計算[9-10],見表7、表8。
表7 標準對照
表8 回收率試驗
取批號為 170 626、170 612、170 701 的本品,每批3份,研細,每份取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入25%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率 250 W,頻率 50 kHz)40 min,放冷,再稱定重量,用25%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。精密吸取上述溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定,記錄峰面積。每份溶液平行進樣2次,求平均峰面積。以平均峰面積照標準對照法計算含量。批號為170 626的樣品采用“重復(fù)性試驗”前3份數(shù)據(jù)見表9、表10。
表9 標準對照
表10 含量測定
由該實驗室另一名操作人員B,使用Kromasil C18 色譜柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm), 以批號為170626的樣品為研究對象,取3份,研細,每份取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入25%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率 50 kHz)40 min,放冷,再稱定重量,用 25%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。精密吸取上述溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定,記錄峰面積。每份溶液平行進樣3次,求平均峰面積。以平均峰面積照標準對照法計算含量,并與“重復(fù)性試驗”前3份數(shù)據(jù)比較,見表11、表12。
表11 標準對照
表12 中間精密度
批號為170 612、170 626、170 701的該品三批制劑中,羥基紅花黃色素A的平均含量分別為1.102 mg/g、1.070 mg/g、1.045 mg/g,三批的平均含量為 1.072 mg/g??紤]到原料藥材產(chǎn)地、種植習(xí)慣、采收加工方法的差異和炮制方法的差異等因素擬以“平均含量×80%”為含量限度,即不低于0.85 mg/g。見圖1。
圖1 含量限度
該試驗的色譜條件參考2015年版 《中國藥典》“紅花”項下相關(guān)內(nèi)容。為配制方便,將流動相從“甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液 (26:2:72)” 改為 “甲醇-0.7%磷酸溶液(30:70)”。在此基礎(chǔ)上,采用供試品溶液進行了耐用性試驗,考察了色譜柱溫度 (28℃、32℃)、流速(1.05 mL/min、0.95 mL/min)、波長(401 nm、405 nm)、流動相組成比例(32:68、28:72)、進樣量(9 μl、11 μl)對色譜分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),上述條件的微小變動,對該試驗中羥基紅花黃色素A的測定未造成影響。
為考察該方中其它中藥飲片對紅花中羥基紅花黃色素A的測定是否存在干擾,該試驗將紅花從處方中除去,其余飲片仍按照【處方】組成比例和制劑工藝制成缺紅花的空白制劑,并按照【含量測定】方法制成供試品溶液,依法測定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該方中除紅花外的其它飲片,對制劑中羥基紅花黃色素A的測定無干擾。
采用高效液相色譜法測定主藥紅花中有效成份羥基紅花黃色素A的含量,準確、簡便,陰性無干擾,可作為本制劑的質(zhì)量標準控制。HPLC法對紅花中的活性成份羥基紅花黃色素A進行測定。結(jié)果表明,該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好,可作為本制劑的質(zhì)量標準控制。