陸奕娜 張林田 盧金素 姚丹儀 呂堅(jiān)羚

汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515031

硒（Se）是人和動(dòng)物所必需的14種微量元素之一[1]，常見(jiàn)的硒形態(tài)有亞硒酸[Se（Ⅳ）]、硒酸[Se（Ⅵ）]、硒胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（SeMeCys）、硒蛋氨酸（SeMet）等。硒在機(jī)體抗癌、抗氧化等方面發(fā)揮著重要作用[2]。人體攝入硒可以增強(qiáng)免疫力、防癌、抗衰老，硒元素?cái)z入不足會(huì)使機(jī)體免疫力和抗氧化能力下降，導(dǎo)致多種疾病[3]。富硒酵母作為一種含硒保健食品，是國(guó)內(nèi)市場(chǎng)目前消費(fèi)較多的補(bǔ)硒制劑。有研究表明人體內(nèi)硒生物活性不僅取決于攝入的總硒量，還與硒的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)[4]。由于動(dòng)物及人對(duì)硒的需要量與中毒量之間的閾值很窄，不同硒形態(tài)的毒性亦不同[5]，因此準(zhǔn)確定性定量分析不同硒形態(tài)對(duì)硒的安全食用具有重要意義。測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性[6]，是評(píng)價(jià)測(cè)量水平準(zhǔn)確度的重要指標(biāo)，是判定測(cè)量結(jié)果可靠程度的依據(jù)[7]。本文建立了液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定富硒酵母中硒形態(tài)的不確定度評(píng)定方法，根據(jù)試驗(yàn)過(guò)程的數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的來(lái)源[8]，對(duì)不確定度分量進(jìn)行計(jì)算，并計(jì)算出硒形態(tài)的檢測(cè)結(jié)果的合成不確定度及擴(kuò)展不確定度。

1 檢測(cè)原理和檢測(cè)過(guò)程

1.1 測(cè)試原理

試驗(yàn)樣品粉碎后經(jīng)蛋白酶XIV溶液37℃水解提取7 h后，用液相色譜對(duì)富硒大米中的硒形態(tài)進(jìn)行分離，并聯(lián)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行比較定量。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀（HPLC，Agilent 1200），電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，Agilent 7700X），天平：感量為0.1mg，水浴振蕩器（昆山一恒 DKZ-3），離心機(jī)（Eppendorf 5417R），去離子水凈水機(jī)（密理博Direct 8），超聲萃取儀（CBL C9860A）。 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供），10 mmol/L檸檬酸溶液（pH 5.60），氨水（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），蛋白酶XIV（百靈威公司）。

1.3 檢測(cè)過(guò)程

稱取1.0000 g富硒酵母于25 mL離心管中，加10 mL水，超聲10 min，加入 20 mg蛋白酶 XIV，在37℃的恒溫水浴搖床上振蕩7 h，10 000 rpm離心，取上清液經(jīng)0.22 μm水性濾膜過(guò)濾后待測(cè)（圖1）。

圖1 硒形態(tài)含量檢測(cè)流程圖

1.4 儀器條件

1.4.1 HPLC條件

Hamilton PRP-X100陰離子分析柱，250 mm×4 mm，10 μm，流動(dòng)相 10 mmol/L 檸檬酸（pH 5.60），梯度洗脫，柱溫30℃，進(jìn)樣量100 μL，洗脫梯度程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 ICP-MS條件

測(cè)質(zhì)量數(shù) 78（Se），m/z 采集模式：TRA，采樣周期：0.8 s，采集時(shí)間：1 200 s，載氣：高純液氬，霧化器：同心霧化器，載氣流速：1.0 L/min，輔助氣流速：0 L/min。

2 建立數(shù)學(xué)模型

樣品中硒形態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式（1）計(jì)算。

式中：w——樣品中硒形態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；

C——測(cè)定液中扣除試劑空白后硒形態(tài)的濃度，μg/mL；

V——樣品萃取液體積，mL；m——樣品質(zhì)量，g。

3 不確定度分量的主要來(lái)源及其分析

液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定富硒酵母中硒形態(tài)含量的不確定度評(píng)定主要有以下5個(gè)來(lái)源：

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：包括標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度和稀釋過(guò)程引入的不確定度。

（2）樣品前處理：包括樣品均勻性、天平的最大允許誤差（MPE）、移液槍定量誤差、溫度引起的水膨脹系數(shù)、樣品回收率等。

（3）最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)得出Co時(shí)所產(chǎn)生的不確定度。

（4）儀器產(chǎn)生的不確定度。

（5）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：使用因果圖（魚骨圖）系統(tǒng)地分析各不確定度來(lái)源，如圖2所示。

圖2 樣品硒形態(tài)不確定度分量的因果關(guān)系圖

4 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定

4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度

5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供，其信息詳見(jiàn)表2所示。

表2 硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液相對(duì)不確定度（證書）

其他硒形態(tài)按照以上公式計(jì)算，其不確定度及相對(duì)不確定度如表2所示。

4.1.2 稀釋過(guò)程引入的不確定度

分別稱取 1.0000 g Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeMeCys及SeMet至標(biāo)準(zhǔn)配備瓶?jī)?nèi)，用去離子水定量至 6.8900 g、7.5100 g、9.3500 g、9.6600 g、 9.7900 g，制成10 μg/g 5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)使用液。使用的天平的最小分度為0.0001 g，根據(jù)鑒定證書該準(zhǔn)確級(jí)的天平在0～50 g的最大允許誤差為±0.0005 g，稀釋過(guò)程各由2次回零稱量所得（儲(chǔ)備液由空瓶重、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液重稱量獲得，稀釋液由儲(chǔ)備液重及稀釋液重稱量獲得），取矩形分布。

則天平的MPE導(dǎo)致的不確定度由以下兩個(gè)不確定度合成：

同理，其他4種硒形態(tài)的稀釋過(guò)程引入的相對(duì)不確定度分別為 0.04118%、0.04105%、0.04104%、0.04104%。

4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度分量：

其他 4 種硒形態(tài) Se（Ⅵ）、SeCys2、SeCys及SeMet由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)不確定度分別為1.5984%，1.3375%，1.3464%，1.2775%。

4.2 樣品前處理過(guò)程引入的不確定度

4.2.1 取樣均勻性

本實(shí)驗(yàn)依照GB/T 5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 理化部分 總則》[9]規(guī)定，將樣品充分混勻后隨機(jī)取樣，可認(rèn)為樣品是均勻的、代表性充分，由此所致的不確定度忽略不計(jì)。

4.2.2 提取過(guò)程

4.2.2.1 稱重

準(zhǔn)確稱取1.0000 g樣品，使用的天平的最小分度為0.0001 g，根據(jù)鑒定證書該準(zhǔn)確級(jí)的天平在0～50 g的最大允許誤差為±0.0005 g，樣品質(zhì)量由2次回零（空瓶mtare和樣重msamp）稱量所得，取矩形分布，則天平的MPE導(dǎo)致的不確定度。

4.2.2.2 移液槍引入的不確定度

JJG 646-2006《移液器》[10]第 5節(jié)規(guī)定10 mL可調(diào)移液器取10 mL的容量允差（Δ）為±0.6%，取矩形分布，則移液器引入的不確定度：

4.2.2.3 溫度引入的不確定度

水的膨脹系數(shù)為 2.1×10-4℃-1，實(shí)驗(yàn)溫度為30℃，容量瓶和溶液溫度與校準(zhǔn)時(shí)不同引起的體積變化所引入的不確定度：

4.2.2.4 回收率引入的不確定度

由于樣品提取不完全導(dǎo)致硒形態(tài)損失或者操作過(guò)程導(dǎo)致硒形態(tài)轉(zhuǎn)變污染等，將使樣品中的硒形態(tài)回收率不能為100%。加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：5種硒形態(tài)的回收率為 a-～a+， Se（Ⅳ）： 89.2%～93.4%、 Se（Ⅵ）、SeCys2、SeMeCys及SeMet，樣品回收率的不確定度按JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》附錄A.1.4節(jié)計(jì)算。區(qū)間半寬度為公式（2）所示。

a+＞a-假如在區(qū)間分布均勻，取矩形分布：

則樣品回收率引入的不確定度如表3所示。

表3 樣品回收率引入的不確定度

4.2.3 樣品前處理引入的不確定度

30 mg蛋白酶量少由其帶入的不確定度忽略不計(jì)。因此上述評(píng)定可知樣品前處理引入的不確定度由 urel（m）、urel（ΔV移）、urel（ΔT）及 urel（Rec）組成，合并前處理不確定度為：

按照此公式計(jì)算，5 種硒形態(tài) Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeMeCys及SeMet由樣品前處理引入的不確定度分別為：1.2673%、3.2828%、1.4619%、2.1110%、1.1029%。

4.3 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)得出Co時(shí)所產(chǎn)生的不確定度

通過(guò)對(duì)質(zhì)量濃度分別為 0、5、10、20、50、100 μg/L的 Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeCys2、SeMeCys 及 SeMet混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)測(cè)定2次，其計(jì)數(shù)值y如表4所示，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與峰面積曲線，用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到方程y=a+bx（a為截距，b為斜率，x為濃度）和相關(guān)系數(shù)r，詳見(jiàn)表4。

表4 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度－計(jì)數(shù)值y

應(yīng)用該曲線，對(duì)C20.0濃度上機(jī)液進(jìn)行了2次測(cè)量，C1[Se（Ⅳ）]=19.57 μg/L，C2[Se（Ⅳ）]＝20.31 μg/L，求得平均濃度 Co[Se（Ⅳ）]=19.94 μg/L，Co[Se（Ⅳ）]的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按照公式（3）計(jì)算[11]。

SCC＝，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的殘差的平方和；

n——標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)量次數(shù)，本例為12；

p——Co的測(cè)量次數(shù)，本例為2。

根據(jù)以上公式推算，其他4種硒形態(tài)線性擬合產(chǎn)生的相對(duì)不確定度見(jiàn)表5。

表5 線性擬合產(chǎn)生的不確定度

4.4 儀器產(chǎn)生的不確定度

由國(guó)家計(jì)量所提供的校準(zhǔn)證書給出的不確定度范圍，按矩形分布計(jì)算不確定度。高效液相色譜的不確定度為0.67%，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的不確定度為9Be為 2.1%、115In為 1.7%、209Bi為 2.8%，取最大不確定度2.8%。

4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度

3 次測(cè)量結(jié)果 ωSe（Ⅳ）：3.59 mg/kg，3.78 mg/kg，3.96 mg/kg，3 次測(cè)量算術(shù)平均值=3.78 mg/kg

根據(jù)JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[12]4.3.2.3節(jié)查得3次測(cè)量的極差R為1.69，則

根據(jù)以上公式推算，其他4種硒形態(tài)重復(fù)試驗(yàn)引入的相對(duì)不確定度見(jiàn)表6。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度

4.5 試劑空白

本實(shí)驗(yàn)所用試劑檸檬酸、氨水、蛋白酶等，均為優(yōu)級(jí)純，因而扣除空白所致的硒形態(tài)的微小變化產(chǎn)生的影響很小，可忽略不計(jì)。

5 不確定度分量列表

根據(jù)以上評(píng)定，將各項(xiàng)相對(duì)不確定度用方和根法合成為相對(duì)合成不確定度。假設(shè)置信概率為0.95時(shí)，取包含因子k=2，則擴(kuò)展相對(duì)不確定度按公式Ucrel=k×ucrel計(jì)算，擴(kuò)展不確定度按 U=×Ucrel計(jì)算。富硒酵母中5種硒形態(tài)不確定度評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 富硒酵母中5種硒形態(tài)不確定度評(píng)定結(jié)果

6 討論

以亞硒酸Se（Ⅳ）為例，LC-ICP-MS聯(lián)用測(cè)定富硒酵母中亞硒酸的不確定度分量對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不確定度分量

由圖3可見(jiàn)，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和曲線擬合產(chǎn)生的不確定度最大。在日常工作中，儀器性能的維護(hù)和調(diào)試非常重要，保證儀器處在最佳工作狀態(tài)，是保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的基礎(chǔ)。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度也較大，試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)當(dāng)提高標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，降低其對(duì)結(jié)果的影響。樣品前處理選擇的萃取方式及萃取試劑也對(duì)不確定度帶來(lái)影響，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)提高樣品萃取過(guò)程及重復(fù)性試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，更接近真實(shí)值。