周廣彪 段建發(fā)胡曉珊 魏 霜 凌 莉 蔡 穎*

1.汕頭海關(guān) 廣東汕頭 515031；2.廣州海關(guān)

擬態(tài)弧菌（Vibrio Mimicus）為革蘭氏陰性菌，單鞭毛，具有動(dòng)力性，與副溶血弧菌、霍亂弧菌等屬正常海洋菌叢，廣泛存在于河水、海水及海產(chǎn)品中，是很多甲殼類及海水魚類的易感菌[1-2]。在美國(guó)、新西蘭、孟加拉及不少非洲國(guó)家均有擬態(tài)弧菌致病報(bào)道，我國(guó)福建、上海、北京、江蘇及浙江地區(qū)也有發(fā)病，多呈散發(fā)或暴發(fā)。擬態(tài)弧菌一年四季均可致病，以夏季為多；潛伏期3～72 h，平均24 h；主要癥狀有腹瀉、嘔吐、腹痛，以及大便呈水樣或粘液血便；發(fā)病年齡不限，但小兒少見。因此，對(duì)擬態(tài)弧菌的檢測(cè)在公共衛(wèi)生上具有十分重要的意義[3-4]。

目前，傳統(tǒng)方法仍是擬態(tài)弧菌檢測(cè)重要手段，該法首先進(jìn)行選擇性增菌，再結(jié)合生化及血清學(xué)結(jié)果進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)方法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，但存在著效率低、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等顯著不足。為滿足致病菌快速檢測(cè)的要求，技術(shù)人員發(fā)展了酶免疫法（EIA）及酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)法（VIDAS-CHL）、膠體金試紙條及API生化鑒定試紙條法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及實(shí)時(shí)熒光PCR法、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等快速靈敏的檢測(cè)方法。其中，以實(shí)時(shí)熒光PCR為代表的分子檢測(cè)方法，以其簡(jiǎn)便快捷、高靈敏度的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，近年來在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用越來越廣泛[5]。但熒光檢測(cè)設(shè)備普遍售價(jià)偏高、產(chǎn)物片段偏小、引物探針設(shè)計(jì)要求較高等應(yīng)用難點(diǎn)，在一定程度上限制了該類技術(shù)推廣，尤其不利于在基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用和非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplifcation，RPA）是繼LAMP之后的新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)之一[6]，利用單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）將DNA雙螺旋解鏈，在ATP的參與下重組酶與引物結(jié)合形成蛋白-核苷酸復(fù)合物，該復(fù)合物與靶序列匹配結(jié)合后再由DNA聚合酶啟動(dòng)合成反應(yīng)。該方法主要具備以下優(yōu)點(diǎn)：（1）37℃左右即可反應(yīng)，不需要梯度溫控來實(shí)現(xiàn)核酸解鏈、退火和延伸；（2）僅需1對(duì)引物，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單；（3）反應(yīng)時(shí)間短，只需 30～50 min；（4）結(jié)果辨識(shí)成本低，使用普通瓊脂糖凝膠電泳即可[7]，而且產(chǎn)物還可進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

目前國(guó)內(nèi)尚未見到利用RPA技術(shù)檢測(cè)擬態(tài)弧菌的報(bào)道，本研究擬根據(jù)編碼擬態(tài)弧菌不耐熱溶血素（Vibrio mimicus heat-labile hemolysin，VmhA）的基因保守序列，設(shè)計(jì)RPA檢測(cè)的引物對(duì)，建立擬態(tài)弧菌的RPA檢測(cè)方法，并測(cè)試其特異性和靈敏度，建立一種能夠快速檢測(cè)擬態(tài)弧菌VmhA的簡(jiǎn)便、高效、特異、靈敏、適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬態(tài)弧菌（ATCC33653）、創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）、副溶血弧菌（ATCC17802）、河流弧菌（ATCC33809）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍亂弧菌（ATCC39315）、哈維氏弧菌（ATCC33842）、沙門菌（ATCC14028）、大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和單增李斯特菌（ATCC19114）均為本機(jī)構(gòu)購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其購(gòu)買來源為中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、廣東食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心和美國(guó)MBL公司。應(yīng)用檢測(cè)的樣品均為本機(jī)構(gòu)2016年法定和委托檢驗(yàn)中的留樣。所用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn) （貨號(hào)DP302），引物由上海生工生物工程有限公司安排合成，電泳級(jí)瓊脂糖、DNA Marker及顯色I(xiàn)劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，RPA擴(kuò)增試劑盒為TwistDX公司產(chǎn)TwistAmp Basic kits。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR 擴(kuò)增儀（Veriti，ABI公司）、核酸蛋白分析儀（ND-1000，Thermo 公司）、電泳儀（DYY-6C，北京六一）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600，天能公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

先將上述標(biāo)準(zhǔn)菌株按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行復(fù)壯增菌及生化鑒定，再參照試劑盒說明書，提取基因組DNA，使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA濃度及純度并統(tǒng)一稀釋為100 ng/μL 備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

參考試劑盒中RPA引物設(shè)計(jì)的要求，根據(jù)VmhA基因的保守序列，使用Oligo V6.22軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和篩選，入選序列再利用Primer Blast工具（NCBI官方網(wǎng)站提供）進(jìn)行特異性確認(rèn)，后由上海生工生物工程有限公司安排合成。最終設(shè)計(jì)檢測(cè)擬態(tài)弧菌的RPA引物，擴(kuò)增條帶467 bp，序列具體如下：上游引物：5′-GAGATATTGGCATCTTTACAAAATGGACGA-3′；下游引物：5′-TGAATCTATTAAGAGGTGCGCA CCCTTCAAGCACT-3′。

1.3.3 RPA檢測(cè)方法建立

以1.3.1中制備的DNA為模板，采用上述引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置超純水為陰性對(duì)照，測(cè)試恒溫37℃反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)分別為30 min、40 min、50 min及60 min時(shí)的擴(kuò)增效果。RPA擴(kuò)增體系的配制方法具體如下：將再水化緩沖液（Rehydration Buffer）29.5 μL加入到含有凍干酶粉的0.2 mL Twist Amp反應(yīng)管（Twist AmpBasic kits，Twist）中，再先后加入去離子水 12.5 μL，上、下游引物各 2 μL（終濃度為 0.4 μmol/L），模板 DNA 1μL，最后再加入醋酸鎂溶液2.5 μL（280 mmol/L）。待反應(yīng)結(jié)束后，向產(chǎn)物中加入 50 μL酚/氯仿，充分混勻后12 000 rpm離心3 min，取上清液4 μL點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，使用1×TBE緩沖液進(jìn)行電泳，電泳條件為5 V/cm，恒壓電泳40～60 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

1.3.4 RPA檢測(cè)方法特異性評(píng)價(jià)

按照1.3.3的RPA檢測(cè)反應(yīng)體系及適用擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)，對(duì)前述11種標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)建立的RPA檢測(cè)方法特異性。

1.3.5 RPA檢測(cè)方法靈敏度評(píng)價(jià)

將擬態(tài)弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株提取的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，設(shè)計(jì)5個(gè)稀釋度，以對(duì)應(yīng)梯度稀釋的DNA為模板，按照1.3.3所示的RPA檢測(cè)反應(yīng)體系進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，并參照已報(bào)道的擬態(tài)弧菌檢測(cè)引物VMH-F和VMH-R進(jìn)行PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)，引物序列 VMH-F：5′-GTCAAAGGGGTATGTGTTAAGGCG TAGTTCTG-3′；VMH-R：5′-CACAGCAGGTTCAAAT CATCGAGCAAACCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 106 bp[5]，比較兩種方法檢測(cè)靈敏度。

1.3.6 RPA檢測(cè)方法應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

選取本機(jī)構(gòu)2016年檢測(cè)留樣樣品50份，包括20份陽(yáng)性樣品，其中擬態(tài)弧菌確認(rèn)陽(yáng)性檢出2份。樣品主要為凍蝦仁、凍鳳尾對(duì)蝦、凍牡蠣、活青蟹、金昌魚以及水質(zhì)監(jiān)控樣本，參考食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品處理，使用堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)10 h，取2 mL增菌液離心富集，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號(hào)DP302）提取DNA，使用建立的RPA方法進(jìn)行擬態(tài)弧菌檢驗(yàn)，以結(jié)果的一致性來評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用效果。

2 結(jié) 果

2.1 RPA檢測(cè)方法的構(gòu)建

以擬態(tài)弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板，并以超純水為陰性對(duì)照，測(cè)試了不同擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)的RPA檢測(cè)效果（圖1）。在40 min時(shí)便可達(dá)到較為理想的擴(kuò)增效果，VmhA擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的條帶大小一致約467 bp，陰性對(duì)照未擴(kuò)增到可見條帶，本實(shí)驗(yàn)所建立的RPA檢測(cè)體系能夠準(zhǔn)確檢測(cè)VmhA基因。

圖1 RPA技術(shù)檢測(cè)VmhA基因的擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)結(jié)果

2.2 RPA檢測(cè)方法的特異性評(píng)價(jià)

VmhA的RPA特異性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，擬態(tài)弧菌能夠擴(kuò)增到467bp的特異性條帶，其他10株標(biāo)準(zhǔn)菌株：創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、哈維氏弧菌、沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均未檢測(cè)到該產(chǎn)物，說明該方法具有較強(qiáng)的特異性（圖2）。

圖2 VmhA基因的RPA特異性檢測(cè)結(jié)果

2.3 RPA檢測(cè)方法的靈敏度比較

對(duì)比VmhA的普通PCR方法與RPA檢測(cè)方法的靈敏度，檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3、圖4），當(dāng)普通PCR反應(yīng)設(shè)置30個(gè)循環(huán)，模板DNA含量為0.1 ng時(shí)，可以檢測(cè)到106 bp的目的條帶；當(dāng)RPA檢測(cè)方法反應(yīng)時(shí)間設(shè)置40 min，模板DNA含量為0.1 ng時(shí)，也可以檢測(cè)467 bp的目的條帶；當(dāng)DNA含量為0.01 ng時(shí)；兩種方法均未能檢測(cè)到目的條帶，說明RPA和普通PCR的靈敏度一致。

圖3 VmhA基因RPA檢測(cè)的靈敏度

圖4 VmhA基因PCR檢測(cè)的靈敏度

2.4 RPA檢測(cè)方法的應(yīng)用效果

應(yīng)用本研究建立的RPA檢測(cè)體系，對(duì)本機(jī)構(gòu)2016年檢測(cè)的20份陽(yáng)性檢出留樣、其中擬態(tài)弧菌確認(rèn)陽(yáng)性檢出2份和30份陰性留樣進(jìn)行了復(fù)檢，結(jié)果共有2份樣本檢出擬態(tài)弧菌，該留樣檢測(cè)結(jié)果與之前傳統(tǒng)培養(yǎng)及生化鑒定的結(jié)果完全一致，表明該方法具有較好的應(yīng)用效果。

3 討論

RPA技術(shù)是近些年興起的常溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，目前在病毒、病原菌及轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)中均有成功的應(yīng)用[8-14]，但尚未見擬態(tài)弧菌的相關(guān)研究報(bào)道。本研究建立了針對(duì)擬態(tài)弧菌特異性VmhA基因的RPA檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了應(yīng)用測(cè)試，結(jié)果顯示該方法特異性強(qiáng)，靈敏度與普通PCR相當(dāng)，可較好應(yīng)用于水生動(dòng)物及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)，且反應(yīng)耗時(shí)短、對(duì)設(shè)備依賴程度低，適合現(xiàn)場(chǎng)及基層單位檢測(cè)應(yīng)用，為擬態(tài)弧菌的疫情監(jiān)控、污染監(jiān)測(cè)等提供了更為簡(jiǎn)便高效的解決手段。

研究表明，擬態(tài)弧菌的致病性是由黏附素、溶血素、腸毒素等多種毒力因子共同作用的結(jié)果，擬態(tài)弧菌不耐熱溶血素由VmhA基因編碼，該基因在擬態(tài)弧菌的臨床及環(huán)境分離的菌株中高度保守，且與與霍亂弧菌溶血素編碼基因的同源性較高，所以也是核酸檢測(cè)、蛋白表達(dá)及抗體制備等方面的研究熱點(diǎn)[5，15-16]。本研究亦是基于VmhA基因保守序列建立了RPA檢測(cè)方法，在特異性、靈敏度及應(yīng)用檢測(cè)方面上也均能滿足實(shí)際檢測(cè)要求。

RPA技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)條件在37℃恒溫反應(yīng)，不需要進(jìn)行復(fù)雜的反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化，本研究對(duì)比測(cè)試不同反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的擴(kuò)增效果，發(fā)現(xiàn)在40 min時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物基本可滿足檢測(cè)需求，考慮時(shí)效性及污染防控，未選用擴(kuò)增更長(zhǎng)但可能更靈敏的反應(yīng)參數(shù)。本文所用的PCR儀、核酸蛋白分析儀及凝膠成像分析系統(tǒng)并非RPA檢測(cè)的必須儀器設(shè)備，有研究表明，使用金屬浴、分光光度計(jì)及簡(jiǎn)易凝膠觀察設(shè)備也可完成RPA檢測(cè)[17-18]，故該方法適用于現(xiàn)場(chǎng)及基層檢測(cè)。此外，RPA技術(shù)反應(yīng)溫度接近人體溫，可不依賴PCR擴(kuò)增儀。有研究人員利用該特性建立了一種僅僅利用人體體溫即能完成DNA擴(kuò)增的RPA檢測(cè)方法[19]，顯著拓展了該技術(shù)的應(yīng)用條件。

靈敏度是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法優(yōu)劣的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，本研究建立的RPA技術(shù)用于檢測(cè)VmhA方法，其靈敏度和普通PCR方法相當(dāng)，此前報(bào)道也證明該技術(shù)與已報(bào)道的LAMP檢測(cè)靈敏度一致[20-21]。但是RPA技術(shù)相比傳統(tǒng)PCR有著反應(yīng)更為快速（僅需30～40 min）、不依賴PCR儀，而對(duì)比LAMP有著引物設(shè)計(jì)難度小、產(chǎn)物片段單一且可測(cè)序確證的優(yōu)點(diǎn)便于后續(xù)進(jìn)行測(cè)序確證。所以RPA技術(shù)在基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中有著更高的實(shí)用價(jià)值。

同PCR方法一樣，RPA技術(shù)也是擴(kuò)增檢測(cè)特定基因序列，該序列與目標(biāo)菌的性狀及行為表現(xiàn)并無必然的對(duì)應(yīng)關(guān)系，當(dāng)目標(biāo)菌數(shù)量較少、活力較弱時(shí)，使用傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)方法不一定能檢出為陽(yáng)性，故在應(yīng)用檢測(cè)中可能存在假陽(yáng)性問題[22]。本研究建立的RPA檢測(cè)方法，對(duì)本機(jī)構(gòu)50份留樣的應(yīng)用檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性問題，可能與研究的樣本數(shù)量偏小有關(guān)。

當(dāng)然，RPA技術(shù)作為一種后起的檢測(cè)手段，也有不足之處需要完善。首先是RPA體系對(duì)于蛋白酶活性要求比較高，需要保證體系中的各種酶促反應(yīng)的準(zhǔn)確進(jìn)行，其技術(shù)的提升依賴現(xiàn)代酶學(xué)的發(fā)展應(yīng)用；其次，RPA擴(kuò)增體系中存在大量蛋白酶，故直接電泳無法分辨出目的核酸片段，必須經(jīng)過純化去除系統(tǒng)內(nèi)所含的蛋白質(zhì)[7]；另外，RPA試劑為英國(guó)劍橋Babraham學(xué)院成立的TwistDx公司獨(dú)家研發(fā)銷售，試劑售價(jià)相對(duì)較高，但目前國(guó)內(nèi)已有公司成功開發(fā)了類似替代產(chǎn)品，相信隨著市場(chǎng)的擴(kuò)大與成熟，其檢測(cè)成本也會(huì)越來越低。作為一種新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，RPA具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作快速便捷等明顯優(yōu)勢(shì)，是現(xiàn)今呼聲最高的“一種可替代PCR的技術(shù)”，在病原體檢測(cè)及食品安全等眾多領(lǐng)域已經(jīng)有了越來越多的推廣應(yīng)用，技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用前景均較為廣闊。