和義敏 章宏峰 李 芃 梁小芳 姜小麗 高 英

脂溢性角化病(Seborrheic Keratosis, SK)、日光性角化病(Actinic Keratosis, AK)及基底細(xì)胞癌(Basal Cell Carcinoma, BCC)是與慢性日光損傷、紫外線輻射有關(guān)的皮膚腫瘤性疾病。三者生物學(xué)行為雖有所不同，但卻有某些共同特點(diǎn)：好發(fā)于老年人，曝光部位多見，病理均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞異常過度增生[1-3]。目前表皮腫瘤的發(fā)病率全球范圍內(nèi)增長(zhǎng)[4]，其發(fā)病機(jī)制的研究顯得尤為重要。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming Growth Factor β, TGFβ)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、遷移、細(xì)胞粘附和免疫反應(yīng)等發(fā)揮重要作用，參與皮膚老化、紫外線照射損傷及表皮腫瘤的發(fā)生[5]。經(jīng)典TGFβ信號(hào)通過激活Smad蛋白發(fā)揮生理作用。Smads蛋白分為受體活化型Smad(R-SMADs)、共同通路型Smad(Co-Smad)以及抑制型Smad(I-Smad)。Smad7及Smad6屬于抑制性Smad蛋白[6]。人類Smad7基因位于18號(hào)染色體，其通過與活化TGFβ受體I結(jié)合以及使R-Smads與Co-Smad復(fù)合物形成等來抑制TGFβ信號(hào)。研究表明，Smad7可對(duì)抗TGF-β介導(dǎo)的纖維化、致癌和炎癥，提示Smad7有治療這些疾病的潛力[7]。本文旨在探討Smad7在脂溢性角化病、日光性角化病以及基底細(xì)胞癌中的表達(dá)并探討其臨床意義。

1 材料及方法

1.1 組織標(biāo)本 SK標(biāo)本，AK標(biāo)本，BCC標(biāo)本及正常標(biāo)本(NS)各30例，均來自本院。臨床和人口資料取自患者檔案，所有病例都經(jīng)兩位皮膚科醫(yī)師在未知皮損部位、年齡和性別情況下重新評(píng)估。石蠟包埋的組織經(jīng)常規(guī)HE染色分別確診為SK, AK, BCC及正常標(biāo)本。正常對(duì)照取自整形科手術(shù)切除的正常皮膚。所有患者均無炎癥系統(tǒng)性疾病或伴有內(nèi)臟腫瘤，術(shù)前均未進(jìn)行放、化療。各組年齡及性別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表 1)。

表1 標(biāo)本的性別及年齡分布

1.2 試劑 Smad7抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司(sc-11392)，稀釋濃度為1∶300；免疫組化試劑盒(封閉液、二抗、SAB復(fù)合物以及DAB顯色試劑)購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.3 免疫組化 將石蠟包埋組織塊切成4 μm厚的組織片，貼于硅烷涂布的載玻片上。采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色。步驟如下：二甲苯脫蠟20 min，經(jīng)過梯度酒精溶液水化，用3% H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶20 min。組織切片置于PH值為6.0的10 mmol/L的枸櫞酸鹽緩沖液中用微波爐加熱法抗原修復(fù)10 min，10%正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合30 min。組織切片上加Smad7抗體后4℃過夜孵育。辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔免疫球蛋白作為二抗室溫孵育20 min，SABC復(fù)合物37℃孵育20 min。DAB作為顯色劑，蘇木精作為復(fù)染劑，依次加入。依照試劑說明，在以上每一步操作后用PBS清洗玻片。除了特殊說明外，所有孵育均在常溫下進(jìn)行。胃癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS用作空白對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 Smad7染色后，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選擇三個(gè)高倍視野 (HPFs,×200) ，每個(gè)視野都數(shù)出100個(gè)角質(zhì)細(xì)胞，計(jì)算出三個(gè)視野中的平均陽(yáng)性細(xì)胞率。采用半定量評(píng)估方法將染色分為四個(gè)等級(jí):陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、陽(yáng)性(++)以及強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[8]，見表 2。

表2 半定量評(píng)估方法

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件分析結(jié)果。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),多組之間陽(yáng)性細(xì)胞率的比較使用方差分析，其中兩兩比較采用方差分析LSD法。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Smad7在正常皮膚的表達(dá) 在正常皮膚標(biāo)本中，Smad7弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，少量表達(dá)于表皮基底層的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。

2.2 Smad7在SK中的表達(dá) 在30例SK中，23例(77%)陽(yáng)性表達(dá)(見表3)；大部分SK標(biāo)本中，Smad7中等陽(yáng)性染色，主要表達(dá)于表皮基底層及棘層的細(xì)胞質(zhì)(圖2)；SK標(biāo)本中Smad7的陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于正常標(biāo)本(見表4)。根據(jù)病理分型[9]，在30例SK中，角化過度型8例，棘層肥厚型11例，腺樣型5例，克隆型6例，其陽(yáng)性細(xì)胞率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.043,P>0.05)。

表3 Smad7的表達(dá) 例

2.3 Smad7在AK中的表達(dá) 在30例AK中，23例(77%)陽(yáng)性表達(dá)(見表3)；大部分AK標(biāo)本中，Smad7中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性染色，表達(dá)于表皮全層的細(xì)胞質(zhì)(圖3)；AK標(biāo)本中Smad7的陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于正常標(biāo)本(見表5)。根據(jù)病理分型[9]，在30例AK中，萎縮型8例，肥厚型6例，原位癌樣型6例，棘層松解型10例，其陽(yáng)性細(xì)胞率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.962,P>0.05)。

表4 SK,AK,BCC與正常組織中Smad7陽(yáng)性率的比較

表5 Smad7表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞率

表6 Smad7陽(yáng)性細(xì)胞率的兩兩比較

圖1 1a：PBS陰性對(duì)照在正常組織中陰性表達(dá)(免疫組化，×200)；1b、1c：Smad7在正常皮膚組織中弱陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化，×200，×400)圖2 2a：PBS陰性對(duì)照在SK中陰性表達(dá)(免疫組化，×200)；2b、2c:Smad7在SK組織中等陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化，×200，×400)圖3 3a:PBS陰性對(duì)照在AK中陰性表達(dá)(免疫組化，×200)；3b、3c：Smad7在AK組織強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化，×200，×400)圖4 4a:PBS陰性對(duì)照在BCC中陰性表達(dá)(免疫組化，×200)；4b、4c:Smad7在BCC組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化，×200，×400)

2.4 Smad7在BCC中的表達(dá) 在30例BCC中，28例(93%)陽(yáng)性表達(dá)(表3)；大部分BCC標(biāo)本中，Smad7強(qiáng)陽(yáng)性染色，表達(dá)于表皮全層及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖4)；BCC標(biāo)本中Smad7的陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于正常標(biāo)本(表5)。根據(jù)病理分型[9]，在30例BCC中，結(jié)節(jié)型10例，淺表型9例，纖維上皮瘤樣型8例，腺樣型3例，其陽(yáng)性細(xì)胞率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.394,P>0.05)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 SK,AK,BCC中Smad7的陽(yáng)性率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而SK、AK、BCC三者的陽(yáng)性率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.801,P=0.15)(見表4,5)。SK、AK、BCC中Smad7的陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BCC的陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于SK與AK,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SK與AK的陽(yáng)性細(xì)胞率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表6)。

3 討論

TGFβ信號(hào)在腫瘤不同時(shí)期發(fā)揮不同作用。在腫瘤早期，TGFβ是抑制因子，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；在腫瘤晚期，TGFβ促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)，參與惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。此外，TGFβ還可通過促進(jìn)血管生成等參與腫瘤侵襲。Smad7作為TGFβ信號(hào)的拮抗劑，比Smad6擁有更多的 TβRI結(jié)合位點(diǎn)，因此Smad7比Smad6發(fā)揮更重要的拮抗作用。Smad7在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)程度與惡性程度呈正相關(guān)，并且對(duì)腫瘤不同時(shí)期的轉(zhuǎn)換起到“開關(guān)”作用。此外，高表達(dá)的Smad7可以增強(qiáng)表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor, EGF)受體信號(hào)的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)由EGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，進(jìn)而調(diào)控腫瘤病程[10]。基于這些機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)Smad7在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，例如乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、膽汁癌、甲狀腺癌、B細(xì)胞淋巴瘤、黑素瘤等[11]。Liu等人利用化學(xué)誘導(dǎo)方法制造小鼠皮膚腫瘤模型，使用原癌基因轉(zhuǎn)染的角質(zhì)細(xì)胞Smad7高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致良性腫瘤上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和鱗狀細(xì)胞癌的迅速發(fā)展[12]。

本實(shí)驗(yàn)中， SK,AK及BCC的Smad7陽(yáng)性細(xì)胞率均明顯高于正常標(biāo)本，并且BCC的陽(yáng)性細(xì)胞率又明顯高于SK與AK。我們推測(cè)，Smad7的高表達(dá)，導(dǎo)致TGFβ、EGF等信號(hào)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致SK,AK以及BCC發(fā)病，并且Smad7有可能是致癌因子，甚至影響其預(yù)后。有研究表明，被不同劑量的紫外線輻射后的AK組織中Smad7的含量明顯升高,而Smad7在鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)[13]，這進(jìn)一步說明Smad7促進(jìn)了皮膚腫瘤的發(fā)展。而Javelaudl等[14，15]的研究發(fā)現(xiàn)Smad7在轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞中有腫瘤抑制作用。故Smad7在皮膚中有促進(jìn)腫瘤及抑制腫瘤兩種作用。由此可見，Smad7不僅僅是TGFβ信號(hào)的拮抗劑，它可能還是許多腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)子[16]，其在AK,SK,BCC等非色素細(xì)胞腫瘤與色素性腫瘤中的致病機(jī)制可能有所不同。

Smad7的這種矛盾的雙重角色在腫瘤性疾病的研究中異常重要。但是這兩種角色切換的具體機(jī)制還不明確，可能與疾病種類以及Smad7基因突變等有關(guān)，Smad7有希望成為表皮腫瘤疾病的理想靶點(diǎn)。