劉廣文， 高振月， 于 爽， 薛金玲， 梁文忠， 蘭 靜， 楊海淼

1 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 Ⅰ期臨床試驗研究室， 長春 130021； 2 正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，s南京 210000； 3 上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司， 上海 215000

HCV是一種感染覆蓋全球的肝炎病毒[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV感染率約3%，感染人數(shù)高達1.95億人[2]。據(jù)報道，到2025年相關死亡率將增加2倍[3]，我國的HCV發(fā)病率為0.06‰，2010年福建部分地區(qū)高達6.01%[4]，每年由HCV導致的肝硬化、肝細胞癌死亡大約有70萬人[5-6]。 目前國際上尚無有效且有針對性的丙型肝炎疫苗可供使用，因此抗HCV藥物治療對防治CHC顯得尤為重要[7]。 長時間以來，干擾素聯(lián)合利巴韋林是我國抗病毒治療無禁忌證的所有基因型HCV感染者的主要方案[8]，直接抗病毒藥物(DAA)的出現(xiàn)標志著慢性丙型肝炎的抗病毒藥物治療取得重大進展。

在我國基因1型HCV感染者的治療方案中，以索磷布韋為基礎的DAA聯(lián)合應用占有很大比重[9]。國外臨床研究[10]顯示，索磷布韋對HCV具有較好的抑制作用，不僅如此，還具有服藥方便，適應證廣、周期短、作用快、不良藥物反應少等優(yōu)點[11]。截至目前，我國尚無國產(chǎn)仿制的索磷布韋片獲批上市，亦未見在中國健康人群中開展仿制藥物的生物等效性相關報道和信息數(shù)據(jù)。本研究根據(jù) 《以藥動學參數(shù)為終點評價指標的化學藥物仿制藥人體生物等效性研究技術指導原則》[12]以及美國食品藥品監(jiān)督管理局2013年頒布的“行業(yè)指南：根據(jù)ANDA草案指南提交的具有藥代動力學終點的藥物的生物等效性研究”[13]，評價國產(chǎn)和進口的兩種藥物的生物等效性，為臨床合理選用藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 受試藥物：索磷布韋片，規(guī)格0.4 g/片，批號180514302，正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)；參比藥物：索磷布韋片索華迪(SOVALDI)400 mg/片，批號17SB001D，Gilead Sciences Ireland UC公司生產(chǎn)。

LC-30AD 高效液相色譜系統(tǒng)由Shimadzu公司提供，API 6500和API 6500+檢測器由Applied Biosystems/Sciex制造商提供。

1.2 受試者選擇 健康受試志愿者均通過長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院臨床試驗招募報名平臺征集，空腹組和餐后組分別在2018年9月18日和9月28日集中進行受試者的篩選體檢，體檢結果符合納入標準后入組?？崭菇M和餐后組各入選40例，其中空腹組有1例完成第一周期試驗后退出，最終39例完成試驗；餐后組有1例完成第一、二周期試驗后退出，最終39例完成試驗?？崭菇M40例中男19例，占比47.5%，年齡(42.6±6.54)歲，BMI(24.39±2.22)kg/m2。餐后組40例中男21例，占比52.5%，年齡(38.3±7.7)歲，BMI(24.39±2.22)kg/m2。

受試者均符合研究方案中所規(guī)定的入選標準，均無既往病史，無藥物濫用史。受試者給藥前檢查結果均為正常或無臨床意義異常，藥物濫用篩查結果未見陽性。試驗前2周內(nèi)未服用任何其他藥物，受試者入住病房期間均統(tǒng)一飲食，禁止劇烈活動，整個試驗期間禁煙、禁酒、咖啡、茶等可能影響藥物代謝的食物或飲料。

1.3 給藥方案、血樣采集與檢測單位檢測采血點 本試驗按單中心、隨機、開放、單次給藥、四周期、完全重復交叉健康人體空腹/餐后狀態(tài)下給藥設計。空腹組和餐后組受試者均隨機分為2組，口服受試藥物或參比藥物索磷布韋片，溫水240 ml送服。索磷布韋的消除半衰期約為0.4 h，清洗期設定為8 d，>7倍半衰期以上。

每周期藥代動力學血樣采集第一天服藥前后2 h禁止飲水(高脂餐和服藥飲用水除外)，4 h后進午餐，10 h后進晚餐，中午、晚上均給標準餐，每周期的用餐計劃應保持一致，給藥后，由研究人員對受試者口腔進行檢查，以確保藥物服用。藥代動力學血樣采集空腹組及餐后組均在給藥前0 h(60 min內(nèi))及給藥后5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、1 h、1.25 h 、1.5 h、1.75 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h 共21個時間點采集靜脈血。每點應用EDTA-K2真空抗凝采血管采集4 ml,輕柔顛倒混勻5次，約2500 r/min離心，離心10 min后，分離血漿，先存入-40 ℃冰箱中，24 h內(nèi)轉移至-80 ℃冰箱儲存，冷鏈運輸至檢測單位待測。

檢測單位分別檢測原形物索磷布韋及其主要代謝物GS-331007。二者采血時間點如下，索磷布韋：給藥前0 h(60 min內(nèi))及給藥后5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、1 h、1.25 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h共15個時間點。代謝物GS-331007：給藥前0 h(60 min內(nèi))及給藥后15 min、45 min、1.25 h、1.5 h、1.75 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h共16個時間點。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 μm, 2.1 mm × 100 mm ，柱溫設置為50 °C；流動相A：0.1%甲酸，流動相B：乙腈含/甲醇溶液(30/70，V/V)。流速：0.4500 ml/min，進樣量：5.0 μl。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式(positive)，多反應監(jiān)測 (MRM)；3000 V；離子源溫度550 ℃；離子源噴霧電壓(IS)：4500 V；氣簾氣(CUR)：35 psi；離子源氣體1(GS1)：70 psi；離子源氣體2(GS2)：70 psi；分辨率Q1/Q3(Resolution Q1/Q3)：Unit/Unit；碰撞氣(CAD)：9.00 unit；選擇監(jiān)測離子對分別是530.2/243.1(索磷布韋)和534.2/247.1(GS-331007)，索磷布韋-13C-d3和GS-331007-13C-d3；去簇電壓(DP)分別為60 V、50 V、40 V、40 V；入口電壓(EP)均為10 V；碰撞能量(CE)分別為66 eV、63 eV、20 eV、25 eV；出口電壓(CXP)分別為29 V、15 V、14 V、14 V。

1.4.3 血漿樣品的預處理與測定 取含藥物血漿50.0 μl，搖板機上搖約5 min充分混勻，加入(25.0 μl內(nèi)標工作溶，加入250 μl的乙腈/甲醇(3/1，V/V)溶液，搖板機上搖約15 min充分混勻，并在約4 ℃、4000 r/min離心10 min，轉移50.0 μl上清液至一新的96孔板中，向樣本中加200 μl水溶液，搖板機上搖約10 min充分混勻，進樣，進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.4.4 標準曲線儲備液與內(nèi)標儲備液的配置 索磷布韋標準曲線儲備液的配置：稱2.139 mg的索磷布韋標準品溶于2107.5 μl DMSO溶劑，得到校正后的終濃度為1.00 mg/ml的儲備液(15Nov18_A_S1)。GS-331007標準曲線儲備液的配置：稱3.015 mg的GS-331007標準品溶于2945 μl DMSO溶劑，得到校正后的終濃度為1.00 mg/ml的儲備液(15Nov18_B_S1)。精密量取適量標準曲線樣品儲備液，采用人血漿樣品稀釋，得到索磷布韋濃度為5、10、25、125、500、2000、4000、5000 ng/ml和GS-33100濃度為10、20、50、250、500、2000、4000、5000 ng/ml的標準曲線樣品濃度值。以上配置的儲備液裝入透明玻璃瓶中，于-20 ℃保存。

索磷布韋-13C-d3儲備溶液的配置：將1 mg的索磷布韋-13C-d3標準品溶于986 μl DMSO溶劑。得到校正后的終濃度為1.00 mg/ml的儲備液。GS-331007-13C-d3儲備溶液的配置：稱1 mg的GS-331007-13C-d3標準品溶于990 μl DMSO溶劑得到校正后的終濃度為1.00 mg/ml的儲備液。

1.5 倫理學審查 本試驗方案由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批號：CCZYFYLL2018S審字-90，所有受試者均在充分知情后自愿簽署知情同意書。

1.6 統(tǒng)計學方法 藥代動力學參數(shù)采用WinNonlin 7.0版本的非房室模型(non-compartmental analysis，NCA)，根據(jù)實際采樣時間點計算，包括索磷布韋Cmax、AUC0-t、AUC0-inf、Tmax、λz、t1/2、CL/F、Vd/F、%AUCex和代謝物(GS-331007)Cmax、AUC0-t、AUC0-inf、Tmax、λz、t1/2、CL/F、Vd/F、%AUCex。使用SAS 9.4軟件版本進行統(tǒng)計分析，采用90%CI分析數(shù)據(jù)。與參比制劑比較，受試制劑的藥代動力學參數(shù)(Cmax、AUC0-t、AUC0-inf)的幾何平均值90%CI均在80%～125%，可以認為2種制劑的藥動學主要參數(shù)無顯著性差異，即生物等效?？崭购筒秃鬆顟B(tài)的生物等效性試驗分開進行計算。

2 結果

2.1 方法學評價

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法學驗證由上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司完成，該方法符合中國藥典生物樣品定量分析方法驗證指導原則[14]的要求。

2.1.1 專屬性 通過分別測試索磷布韋和GS-3310076對6個不同來源空白基質(zhì)、待測物對內(nèi)標，內(nèi)標對待測物均無干擾。說明具有良好的專屬性。

2.1.2 標準曲線與定量下限 以分析物(索磷布韋和GS-331007)與內(nèi)標(索磷布韋-13C-d3和GS-331007-13C-d3) 的色譜峰面積比為縱坐標，用加權(W=1/x2)最小二乘法以血漿中分析物的質(zhì)量濃度(x)與峰面積比(y)進行線性回歸，索磷布韋血藥濃度在5～5000 ng/ml呈良好線性關系，最低定量下限(LLOQ)為5 ng/ml；GS-331007血藥濃度在10～5000 ng/ml呈良好線性關系，LLOQ為10 ng/ml。

2.1.3 精密度和準確率 按照標準曲線儲備液的操作流程，配置索磷布韋5個濃度(5、15、250、2500和3750 ng/ml)和GS-331007的5個濃度(10、30、500、2500和3750 ng/ml)的質(zhì)控樣品；均按照血漿的預處理與測定進行處理和分析，分批次制備并分別測定3 d得到質(zhì)控樣品的濃度，計算本方法的精準度和準確率，結果見表1 。

表1 精準度和準確度結果

2.1.4 提取回收率和基質(zhì)效應 配制中間溶液，參照樣品處理過程，計算真實質(zhì)控樣品(L、M、H)萃取后化合物與內(nèi)標最終在儀器進樣的理論濃度值，根據(jù)理論濃度進行稀釋，精確量取10.0 μl LQC、MQC、HQC工作液和100 μl內(nèi)標工作液混合，使用5490 μl的水分別稀釋得到N-LQC、N-MQC、 N-HQC。經(jīng)提取后的樣品用配制的真實質(zhì)控樣品(L、M、H)按照樣品處理過程萃取后獲得。提取回收率計算：在提取后的質(zhì)控樣品中待測物和內(nèi)標的峰面積除以空白血漿提取物與凈溶液混合后待測物和內(nèi)標的峰面積的比值。提取的樣品中，高濃度待測物索磷布韋提取回收率均值118.5%，CV為2.9%，高濃度待測物GS-331007提取回收率均值95.6%，CV為4.8%。中濃度待測物索磷布韋提取回收率均值118.6%， CV為1.8%，中濃度待測物GS-331007提取回收率均值93.5%，CV為2.2%。低濃度待測物索磷布韋提取回收率均值112.3%，CV為5.5%，低濃度待測物GS-331007提取回收率均值91.8%，CV為4.4%。內(nèi)標索磷布韋-13C-d3提取回收率均值114.4，CV為4.7%，內(nèi)標GS-331007-13C-d3提取回收率均值93.1，CV為3.5%。

配制中間溶液，參照上述過程分別稀釋得到N-LQC、 N-MQC、 N-HQC。生物基質(zhì)相基質(zhì)效應樣品的配制，在96孔板中加入50.0 μl 空白單個人血漿，按照樣品處理過程處理，提取上清后加入200 μl低、中、高溶液(N-LQC、N-MQC、N-HQC)，使其濃度與萃取后真實質(zhì)控樣品(L、M、H)中化合物和內(nèi)標的理論濃度相同。使用生物基質(zhì)相面積和溶劑相面積比較得到待測物和內(nèi)標面積比，獲得歸一化基質(zhì)效應因子。索磷布韋的內(nèi)標化平均歸一化基質(zhì)效應為LQC 1.00、MQC 0.98、HQC 0.98。GS-331007的內(nèi)標化平均歸一化基質(zhì)效應為LQC 1.12、MQC 1.01、HQC 1.04，分析物索磷布韋經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子的相對標準偏差分別為4.0%、1.2%、0.5%。GS-331007基質(zhì)因子的相對標準偏差分別為7.0%、1.7%、2.0%，均滿足相對標準偏差不超過15%的接受標準，表明無明顯基質(zhì)效應。

2.1.5 穩(wěn)定性 低、高濃度質(zhì)控樣品在室溫放置23.9 h，-20 ℃冷凍放置24 d，-20 ℃連續(xù)5次凍融循環(huán)，80 ℃連續(xù)5次凍融循環(huán)，生物樣品前處理過程中在白光室溫2 h、黃光冰浴下22 h，制備后樣本6 ℃放置147 h，待測物血漿樣品在20 ℃條件下儲存18 d、44 d和80 ℃條件下儲存44 d、132 d后進行測試分析，結果表明準確度偏差均小于15%，說明具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 藥代動力學參數(shù) 空腹狀態(tài)下40例健康受試者口服受試制劑或參比制劑后，不同時點測定索磷布韋的平均血藥濃度-時間曲線見圖1，測定GS-331007平均血藥濃度-時間曲線見圖2。餐后狀態(tài)下40例受試者口服受試制劑或參比制劑后，不同時點測定索磷布韋的平均血藥濃度-時間曲線見圖3，GS-331007平均血藥濃度-時間曲線見圖4。

2.3 生物等效性評價

2.3.1 空腹 以索磷布韋及其代謝物(GS-331007)的主要藥代動力學參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-inf評價受試制劑與參比制劑的生物等效性，Cmax、AUC經(jīng)對數(shù)轉換后進行方差分析，索磷布韋Cmax、AUC0-t、AUC0-inf幾何均值比值分別為90.55%、97.26%和94.62%，GS-331007Cmax、AUC0-t、AUC0-inf幾何均值比值分別為98.91%、98.98%和99.46%，均在80.00%～125.00%；方差分析結果顯示序列、周期、制劑對Cmax、AUC0-t、AUC0-inf均無顯著影響(P值均>0.05)；個體間存在差異(表2、3)。按照生物等效性判定標準，可判定2種制劑生物等效。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析，數(shù)（n）和率（%）表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗；采用Logistic回歸模型實施多因素分析；P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2.3.2 餐后 以索磷布韋及其代謝物(GS-331007)的主要藥代動力學參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-inf評價受試制劑與參比制劑的生物等效性，Cmax、AUC經(jīng)對數(shù)轉換后進行方差分析，索磷布韋Cmax、AUC0-t、AUC0-inf幾何均值比值分別為83.3%、91.53%和93.28%，GS-331007Cmax、AUC0-t、AUC0-inf幾何均值比值分別為100.63%、100.84%、101.01%，均在80.00%～125.00%；方差分析結果顯示序列、周期、制劑對Cmax、AUC0-t、AUC0-inf均無顯著影響(P值均>0.05)；個體間存在差異(表4、5)。按照生物等效性判定標準，可判定2種制劑生物等效。

2.4 安全性評價 40例受試者全部進入安全性數(shù)據(jù)分析集，一般狀況良好，無明顯不良反應，空腹組有10例受試者出現(xiàn)11例次不良事件，其中貧血3例(7.5%)，尿隱血4例(10%)。餐后組有14例受試者出現(xiàn)20例次不良事件，其中貧血6例(15%)，尿隱血4例(10%)。所有不良事件均未經(jīng)治療恢復正常，試驗結果顯示受試制劑與參比制劑安全性均較好。

表2 空腹狀態(tài)下服用索磷布韋片受試制劑和參比制劑后索磷布韋的生物等效性評價結果

表3 空腹狀態(tài)下服用索磷布韋片受試制劑和參比制劑后GS-331007的生物等效性評價結果

表4 餐后狀態(tài)下服用索磷布韋片受試制劑和參比制劑后索磷布韋的生物等效性評價結果

3 討論

本次索磷布韋片在空腹和餐后狀態(tài)下口服0.4 g/片受試制劑和參比制劑后藥代動力學特點顯示，受試制劑和參比制劑空腹試驗及餐后試驗藥代動力學變化趨勢相同，食物對藥物的Cmax無影響，其受試制劑安全性良好，兩種制劑在空腹和餐后狀態(tài)下均具有生物等效性。索磷布韋是第一個上市的核苷類NS5B、RNA聚合酶抑制劑，對人類的DNA和RNA聚合酶、線粒體RNA無明顯的抑制作用，故少有不良反應[15]。本研究中出現(xiàn)的貧血不良事件與國外數(shù)據(jù)[16-18]和相關文獻報道[19]在治療慢性丙型肝炎患者中出現(xiàn)貧血事件相符合，說明該藥物在患者和健康人中均會出現(xiàn)貧血的不良事件。在該項研究中共出現(xiàn)10例尿隱血不良事件，目前未見相關文獻報道，值得今后的試驗研究中特別關注。

本研究采用了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定K2EDTA人血漿中索磷布韋和代謝物GS-331007濃度，該生物分析方法采用蛋白沉淀法對樣品進行前處理，在多反應監(jiān)測模式下，基于電噴霧電離技術，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析測定樣品濃度。LC-MS/MS方法具有高選擇性、高靈敏度，適于廣泛應用。

隨著DAA的不斷研發(fā)和應用，更加高效、短療程、易耐受、服用方便的藥物也必將不斷被發(fā)掘，索磷布韋等抗病毒藥物必將為全人類丙型肝炎患者造福，消滅慢性丙型肝炎指日可待。

作者貢獻聲明：劉廣文、高振月負責課題設計，資料分析，撰寫論文；于爽、薛金玲、梁文忠、蘭靜參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；楊海淼負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。