周 大 勇， 周 新， 劉 瀟 陽， 沈 燕， 于 卓 良

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

海星(Asteriasamurensis)屬棘皮動物門海星綱，資源豐富，分布廣泛。海星為肉食性動物，專以扇貝、鮑魚等海珍品為食，嚴重影響沿海地區(qū)的貝類養(yǎng)殖[1]。若能對海星進行有效的開發(fā)利用，使其作為營養(yǎng)、無毒的新型海洋食品原料，則可以化害為利。近年來研究發(fā)現(xiàn)，海星含有蛋白質(zhì)(多肽、氨基酸)、多糖、皂苷、甾醇、類胡蘿卜素和腦苷脂等多種功能成分[2]，因而具有藥用和保健功能。但海星中的脂質(zhì)作為重要營養(yǎng)成分之一其研究相對較少，缺乏系統(tǒng)性和完善性的研究成果。本實驗以海星性腺與體壁為原料，分析了脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)、脂質(zhì)組成、脂肪酸組成、磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)質(zhì)量分數(shù)、磷脂分子種等脂質(zhì)信息，有助于開發(fā)新型功能保健食品，以期為海星資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

海星：遼寧省大連市長興市場購買。

LG-1.0型真空冷凍干燥機，沈陽航天新陽速凍設(shè)備制造有限公司；MK-6S棒狀薄層色皮分析儀，雅特隆公司；Agilent 6890N氣相色譜儀、Agilent 5973質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；LC-20AD 型高效液相色譜儀，日本島津公司；ELSD6000蒸發(fā)光檢測器，美國奧特奇生物技術(shù)公司；流動注射泵，美國Harvard Apparatus公司；4000 QTRAP質(zhì)譜儀，AB Sciex中國公司。

磷脂標準品(PC：12：0/12：0，16：0/18：1; PE：12：0/12：0，16：0/18：1)，Avanti公司；正己烷，上海國藥集團；異丙醇，博歐特生物科技有限公司；冰乙酸、三乙胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、三氯甲烷、甲酸銨，Sigma中國有限公司；其他試劑購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 原料預處理

將海星體壁和性腺分開后冷凍干燥，經(jīng)粉碎后置于-80 ℃冰箱存放待用。

1.2.2 脂質(zhì)提取

利用甲基叔丁基醚(MTBE)法提取海星總脂成分[3]，于-30 ℃儲藏待用。

1.2.3 脂質(zhì)含量計算

海星脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)按公式(1)計算。

w=m0/m

(1)

式中：m0為海星脂質(zhì)質(zhì)量；m為原料質(zhì)量。

1.2.4 脂肪酸組成分析

利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析法(GC-MS)檢測海星脂質(zhì)樣品的脂肪酸組成[4]。質(zhì)譜參數(shù)：安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀(7890A GC-5975C MSD)，HP-5-MS毛細管柱(30 m×0.25 m×0.25 μm)，EI源(70 eV)。根據(jù)GC-MS中各組分保留時間以及質(zhì)譜圖，對比脂肪酸標準品，并在NIST02庫檢索鑒定，通過峰面積歸一法各類脂的脂肪酸組成及相對質(zhì)量分數(shù)。

1.2.5 脂質(zhì)組成分析

利用棒狀薄層色譜-氫火焰離子檢測器聯(lián)用分析法(TLC-FID)檢測各類脂質(zhì)樣品的組成及質(zhì)量分數(shù)[4]。檢測參數(shù)：掃描速度30 s/根，空氣體積流量2 L/min，氫氣體積流量160 mL/min。利用分析軟件對所得譜圖各脂質(zhì)成分的峰進行積分，采用峰面積歸一化法得到各類脂質(zhì)成分的相對質(zhì)量分數(shù)。

1.2.6 PC及PE定量分析

利用高效液相色譜串聯(lián)蒸發(fā)光檢測器(HPLC-ELSD)檢測各類樣品脂質(zhì)中PC、PE絕對質(zhì)量分數(shù)。HPLC檢測條件：色譜柱Agilent Zorbax RX-SIL柱，4.6 mm×250 mm，5 μm。流動相A：體積比85∶15∶0.45∶0.05的甲醇、水、冰乙酸、三乙胺混合溶液；流動相B：體積比20∶48∶32 的正己烷、異丙醇、流動相A混合溶液；洗脫方式為梯度洗脫。洗脫條件：0～20 min，90%～70% B；21～35 min，70%～50% B；36～41 min，90% B。體積流量1 mL/min，進樣體積10 μL。檢測器參數(shù)：漂移管溫度75 ℃，霧化器體積流量2 L/min，光電倍增管的增益因子為1。PC(16：0/18：1)和PE(16：0/18：1)作為標準品，繪制標準曲線。

1.2.7 磷脂分子種分析

利用直接進樣電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)方法定性、定量檢測海星甘油磷脂分子種[5-6]。質(zhì)譜參數(shù)：ESI源正離子模式下噴霧電壓5 500 V，負離子模式下噴霧電壓-4 500 V，霧化氣壓和渦輪氣壓分別為172.4和206.8 kPa，離子源溫度425 ℃，掃描范圍m/z350～1 000。樣品檢測：通過加內(nèi)標進行半定量分析定量檢測磷脂分子種相對質(zhì)量分數(shù)。定量海星GPCho和GPEtn時，二種部位樣品的質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，進樣體積流量分別為5和10 μL，加入內(nèi)標分別為PC 12：0/12：0、PE 12：0/12：0，內(nèi)標質(zhì)量濃度為0.35、0.45 μg/mL。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

脂質(zhì)分析實驗均做3次平行檢測，數(shù)據(jù)以(平均值±標準差)表示，并使用SPSS 16.0軟件進行獨立T檢驗，以P<0.05表示存在顯著性差異，以P<0.01表示存在極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂質(zhì)含量

采用MTBE法提取海星油脂，測得海星性腺、體壁脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)分別為(13.39±0.60)%和(4.34±0.21)%。

海星不同部位脂質(zhì)含量差異較大。性腺作為海星可食部分，其油脂質(zhì)量分數(shù)相對較高，而海星體壁中油脂質(zhì)量分數(shù)較低。李紅艷等[7]研究結(jié)果表明海星性腺脂肪質(zhì)量分數(shù)為39.22%，體壁脂肪質(zhì)量分數(shù)為1.54%，推測可能是海星收集地點、季節(jié)等不同導致檢測結(jié)果的差異性。Shah等[8]研究表明季節(jié)差異對于海星脂質(zhì)含量及組成影響較大。

2.2 脂肪酸組成

GC-MS測定海星性腺與體壁脂肪酸組成，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，海星脂質(zhì)中脂肪酸主要包括C16：0、C18：0、C20：1n-9、C20：5n-3(EPA)和C22：6n-3(DHA)。海星性腺和體壁PUFA質(zhì)量分數(shù)分別為57.35%和49.53%，其中EPA和DHA質(zhì)量分數(shù)分別為26.36%～30.10%和7.79%～10.35%。李紅艷等[7]研究海星脂質(zhì)發(fā)現(xiàn)，海星性腺和體壁中PUFA質(zhì)量分數(shù)分別為48.92%和50.00%，以EPA、DHA為主。雖然海星體壁脂肪酸含量較低，但是其種類豐富，且含有豐富的PUFA，可用于功能保健食品的開發(fā)。

2.3 脂質(zhì)組成

利用TLC-FID測定海星不同部位脂質(zhì)組成，結(jié)果如表2所示。海星脂質(zhì)成分含有極性脂(PoL)、甘油三酯(TAG)、二酰甘油(DAG)、游離脂肪酸(FFA)、膽固醇(CHO)等5種，其中PoL質(zhì)量分數(shù)最高，可達總脂的73.70%～86.69%。海星中TAG質(zhì)量分數(shù)較低，為總脂的7.07%～18.62%。杜磊等[9]通過體內(nèi)、體外實驗研究海星脂質(zhì)功能作用發(fā)現(xiàn)，海星中磷脂極性脂質(zhì)體具有較強的抗腫瘤活性?？梢姾Ｐ强勺鳛榱字a(chǎn)品開發(fā)的新型原料，海星資源得到有效的利用。

表1 海星不同部位的脂肪酸組成

表2 海星不同部位的脂質(zhì)組成

2.4 主要磷脂含量

海星磷脂中主要含有PC和PE[10-11]，利用HPLC-ELSD進行檢測，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，海星性腺中PC和PE含量豐富，性腺較體壁中的含量更高。Kostetsky等[12]研究表明，海星磷脂質(zhì)量分數(shù)為總脂的(32.1±0.5)%，PC、PE分別為磷脂的50.4%、25.6%，是海星器官中主要的磷脂成分。PC、PE是重要的功能性磷脂成分，是維持人體新陳代謝必須物質(zhì)之一，具有重要的生理功能[13]。海星中PC、PE質(zhì)量分數(shù)豐富，可作為新型保健功能食品的原料。

表3 海星不同部位磷脂中PC和PE質(zhì)量分數(shù)

2.5 不同部位磷脂的分子種輪廓

2.5.1 不同部位磷脂分子種定性分析

甘油磷脂GPCho、GPEtn通過直接進樣法檢測，質(zhì)譜特征性掃描得相應磷脂一級質(zhì)譜圖，如圖1所示。

根據(jù)一級質(zhì)譜圖質(zhì)量數(shù)信息初步鑒定分子種，但是甘油磷脂sn-1、sn-2位脂肪酸的結(jié)構(gòu)信息不能具體給出，需進行二級質(zhì)譜掃描。根據(jù)裂解碎片信息，以進一步推導磷脂的準確結(jié)構(gòu)。海星甘油磷脂GPCho、GPEtn分子種結(jié)構(gòu)推導根據(jù)Yin等[5]的描述。

(a) GPCho

(b) GPEtn

2.5.2 不同部位磷脂分子種定量分析

采用內(nèi)標法定量檢測海星磷脂分子種，根據(jù)一級譜信號強度計算GPCho、GPEtn分子種相對質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表4～5。由表4、表5可知，海星GPCho、GPEtn分子種結(jié)構(gòu)分別有38種和34種。GPCho中主要含有phosphatidyl 18：1/20：5、18：1/22：5和20：1/20：5，plasmenyl 18：3/20：1和20：3/18：1，plasmanyl 18：4/20：1和20：4/18：1。GPEtn中主要含有phosphatidyl 18：0/20：5、18：1/20：1和20：3/20：5，plasmenyl 20：3/20：5和plasmanyl 20：4/20：5。由此可見，海星中主要分子種脂肪酸為C20：5，在海星性腺中質(zhì)量分數(shù)相對更高。Kostetsky等[14]推測海星PC分子種25種，其主要結(jié)構(gòu)為16：0/20：5和18：0/20：5；推測海星PE分子種27種，其主要結(jié)構(gòu)為18：0/20：5和18：0/20：4。相對于甘油酯型PUFA，磷脂型PUFA具有更好的生物利用度、組織傳送能力和促進健康的作用[15]。因此，海星可作為提取磷脂型PUFA的新型原料，促進海星資源的開發(fā)利用[16-17]。

表4 海星不同部位GPCho分子種定量分析結(jié)果

續(xù)表

表5 海星不同部位GPEtn分子種定量分析結(jié)果

810Phosphatidyl 20:5/22:60.10±0.010.12±0.02812Phosphatidyl 20:5/22:5Phosphatidyl 20:4/22:60.63±0.02**0.31±0.05

3 結(jié) 論

海星性腺油脂含量較高，為(13.39±0.06)%，體壁油脂質(zhì)量分數(shù)僅為(4.34±0.21)%。海星油脂中PUFA質(zhì)量分數(shù)較高，為總脂的49.53%～57.35%，以EPA、DHA為主。另外，海星性腺與體壁含有TAG、DAG、PoL、FFA和CHO等成分，其中PoL最為豐富，占總脂的73.70%～86.60%。海星磷脂以PC、PE為主，分別定性、定量分析得到70種分子種結(jié)構(gòu)，主要包含的脂肪酸為C20：5。

海星脂質(zhì)信息豐富，含有較多的PoL、PUFA以及磷脂型EPA等功能性脂質(zhì)成分，具有重要的營養(yǎng)功能價值，可開發(fā)新型功能保健食品。