李寒梅,唐勇軍,王順啟,代建國*

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國江西南昌330031;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,中國廣東深圳518000)

鱟又稱馬蹄鱟(horseshoe crab),是一種非常古老的海洋動(dòng)物,其血液為藍(lán)色,出現(xiàn)在古生代寒武紀(jì),且近4億年來形態(tài)未發(fā)生變化,具有“生物活化石”的稱號(hào)[1]。這種頻臨滅絕的古生物目前主要包括東方鱟(又稱中國鱟或日本鱟)(Tachypleus tridentatus)和美洲鱟(Limulus polyphemus)。自日本學(xué)者Nakamura等[2]首次從東方鱟血細(xì)胞分離純化制得小分子多肽鱟素(tachyplesin,TP)后,其他結(jié)構(gòu)類似物也先后得到發(fā)現(xiàn),目前主要包括東方TP-Ⅰ、TP-Ⅱ、TP-Ⅲ和美洲鱟素Ⅰ(polyphemusinⅠ)、美洲鱟素Ⅱ(polyphemusinⅡ),共計(jì)5種,其一級(jí)結(jié)構(gòu)見表1。幾種鱟素肽的共同特點(diǎn)表現(xiàn)為相對(duì)分子質(zhì)量小、同源性高、生物活性廣泛、研發(fā)價(jià)值突出。近30年來,國內(nèi)外對(duì)TPs進(jìn)行了比較深入、系統(tǒng)的研究,并且取得積極進(jìn)展。本文通過總結(jié)分析,對(duì)此領(lǐng)域研究進(jìn)行了較為詳盡的綜述,希望能為TPs類抗菌肽的研發(fā)提供參考。

1 TPs分子結(jié)構(gòu)和生物活性

1.1 分子結(jié)構(gòu)

TP-Ⅰ是由17個(gè)氨基酸組成的、存在于東方鱟血細(xì)胞中的小分子多肽,相對(duì)分子質(zhì)量為2 263,等電點(diǎn)(isoelectric point,pI)約為12.3,內(nèi)含2個(gè)二硫鍵,二級(jí)結(jié)構(gòu)為2個(gè)逆向平行的β-折疊通過1個(gè)β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)連接[1]。TP-Ⅱ、TP-Ⅲ和polyphemusinⅠ、polyphemusinⅡ均是TP-Ⅰ的類似物,從表1中可以看出,TP-Ⅱ與TP-Ⅰ的區(qū)別是第1位的K和第15位的R互換位置,而TP-Ⅲ與TP-Ⅰ的區(qū)別是第15位的R由K替換。Polyphemusins是從美洲鱟血細(xì)胞中分離出來的、含有18個(gè)氨基酸殘基的短肽,也具有反向平行的β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu),從表1中可以看出,polyphemusins與TP-Ⅰ相比N-末端多出1個(gè)精氨酸殘基,而polyphemusinⅠ與polyphemusinⅡ只有第10位氨基酸的差別[1]。相對(duì)于其他抗菌肽,TPs結(jié)構(gòu)比較獨(dú)特,均是具有C-末端α-精氨酰胺結(jié)構(gòu)的兩親性陽離子肽,氨基酸殘基之間具有極高同源性,分子內(nèi)含3個(gè)串聯(lián)的四肽重復(fù),且以2個(gè)分子內(nèi)二硫鍵形成獨(dú)特的穩(wěn)固結(jié)構(gòu)。

1.2 生物活性

TP-Ⅰ、TP-Ⅱ、TP-Ⅲ和 polyphemusinⅠ、polyphemusinⅡ之間有很高的結(jié)構(gòu)同源性,因此也有著相似的生物活性,既可以抑殺革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌,也可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,還可以強(qiáng)烈抑制出血熱病毒、流感病毒A、HIV-Ⅰ等病毒和藻類細(xì)胞?；赥Ps比較全面的生物活性,目前國內(nèi)外正在不斷研究,期待開發(fā)以TPs為先導(dǎo)化合物的新藥物,以解決越來越多的致病菌對(duì)抗生素的耐藥性問題。

1.2.1 抗細(xì)菌和藻類

TPs類肽對(duì)細(xì)菌具有很大程度上的抑殺作用,且抗菌譜較普通抗生素寬,通過研究發(fā)現(xiàn)TP-Ⅰ對(duì)變形桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌具有明顯的抑殺作用,對(duì)隱球菌和枯草桿菌等革蘭氏陽性菌也有一定的抑制作用[3,4]。在抗菌時(shí),TPs與其他抗菌肽之間、甚至TPs與抗生素之間具有一定的協(xié)同作用,兩者或多者聯(lián)用可以拓寬抗生素抗菌譜,提高藥物療效且不增加溶血活性。相關(guān)研究報(bào)道,TP-Ⅲ與哌拉西林-他唑巴坦(piperacillin-tazobactam)聯(lián)合使用可防止假單胞菌體外生物膜的形成,與克拉霉素(clarithromycin)聯(lián)合使用可以顯著降低感染致病性大腸桿菌小鼠的數(shù)量[5,6]。另有脂質(zhì)體染料釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TP-Ⅰ環(huán)狀結(jié)構(gòu)與蛙皮素(magainin 2)可選擇性協(xié)同作用于膜透化中的特異性陰離子磷脂分子,而TP-Ⅰ線性類似物與粘菌素(colistin,CST)組合使用可明顯抑制銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌生物膜的形成,對(duì)于已成形24 h的生物膜也有抑制作用[7,8]。黃莉莉等[9]通過研究發(fā)現(xiàn),TP-I處理過的小球藻的細(xì)胞數(shù)、葉綠素a含量、超氧化物歧化酶等均有一定變化,且隨TP-Ⅰ濃度增加而不斷降低,說明除細(xì)菌外TP-Ⅰ也能抑殺小球藻類。

1.2.2 抗真菌與寄生蟲

除細(xì)菌外,TPs還能抑殺真菌和寄生蟲。目前已有7萬多種真菌被發(fā)現(xiàn),部分真菌和寄生蟲給人類健康、動(dòng)物生存、植物生長等帶來一定程度的威脅,而TPs抗菌肽則能有效抑殺這些引起人類及動(dòng)植物疾病的真菌[10]和寄生蟲。簡琛等[11]測定TP-Ⅰ對(duì)畢赤酵母菌GS115、里氏木霉菌QM9414的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)均不超過40 mg/L,可見TP-Ⅰ具有明顯的抗真菌活性。另有文獻(xiàn)報(bào)道,TP-Ⅰ可改變牡蠣派金蟲和包那米蟲的微觀結(jié)構(gòu),其存活率隨TP-Ⅰ濃度的增加而降低[12]。Simonetti等[13]在研究抗霉菌劑時(shí)發(fā)現(xiàn),TP-Ⅲ可與特比萘芬(terbinafine)聯(lián)合使用,以治療真菌引起的皮膚癬菌病。Xu等[14]的研究顯示,通過畢赤酵母菌SMD1168基因工程表達(dá)的TP-Ⅱ?qū)?xì)菌、真菌等均有抑制活性。1996年,美國的Rao等[15,16]將TPs編碼基因成功插入玉米基因組中,表達(dá)產(chǎn)物速激肽能對(duì)抗植物病原真菌和種子病原體,如：禾谷鐮刀菌、鐮孢菌、黃曲霉等。

表1 5種鱟源肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)Table1 Primary structure of five antimicrobial peptides from horseshoe crab

1.2.3 抗病毒與抗腫瘤

病毒通過感染生物細(xì)胞進(jìn)行自我復(fù)制,而腫瘤細(xì)胞則在機(jī)體內(nèi)不斷進(jìn)行分裂,兩者均會(huì)嚴(yán)重威脅人類健康,給人們?cè)斐奢^為頑固性的疾病。TPs類抗菌肽對(duì)病毒和腫瘤有廣譜的抑制失活作用,主要是通過影響腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)胞分裂等方式發(fā)揮作用。目前認(rèn)為,polyphemusinⅡ復(fù)合物T22([Tyr5,12,Lys7]-polyphemusinⅡ)可阻止HIV與細(xì)胞的識(shí)別和融合,并通過與HIV病毒上的趨化因子受體CXCR4結(jié)合從而達(dá)到高效抑制HIV的作用[17]。有關(guān)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells,GSCs)的研究發(fā)現(xiàn),TP-Ⅰ濃度為10～40 mg/L時(shí),可通過破壞細(xì)胞膜并誘導(dǎo)GSCs分化來抑制GSCs的增殖,高濃度時(shí)可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的分裂和活性[18,19]。此外,有學(xué)者在探討TPs和丁酸鈉對(duì)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞增殖和基因表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),兩者抑制作用相似,并且在抑制腫瘤細(xì)胞的分化方面具有協(xié)同作用[20]。施文榮等[21]通過熒光技術(shù)、共聚焦顯微鏡和電鏡觀察發(fā)現(xiàn),低濃度TP-Ⅰ引起人胃腺癌BGC-823細(xì)胞膜可逆性通透,高濃度影響B(tài)GC-823細(xì)胞分裂。

2 TPs作用機(jī)制

雖然近年來,研究人員在抗菌肽結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)[22]、修飾改造以及作用機(jī)制等方面進(jìn)行了大量研究,但自然界中已被發(fā)現(xiàn)的不同來源抗菌肽之間,存在氨基酸組成及空間構(gòu)象的差異,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同的抗菌肽可能存在不同的抗菌機(jī)制,從而導(dǎo)致抗菌機(jī)制無法統(tǒng)一,只能針對(duì)某來源或某類抗菌肽進(jìn)行研究。TPs類抗菌肽的抑殺菌機(jī)制也未完全闡明,目前,人們發(fā)現(xiàn)的TPs類抗菌肽抑制機(jī)制主要體現(xiàn)在以下幾方面。

2.1 與細(xì)胞膜的相互作用

TPs通過電荷性、兩親性與胞膜結(jié)合,可改變膜的通透性,在胞膜上形成穿膜孔道,引起胞內(nèi)物質(zhì)滲出,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。相關(guān)研究表明,電正性的TP-Ⅰ和原核生物電負(fù)性的細(xì)胞膜結(jié)合,達(dá)到一定濃度后損害細(xì)胞膜完整性從而使細(xì)菌失活[23,24]。Kushibiki等[25]研究表明,TP-Ⅰ與革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)之間具有很強(qiáng)的結(jié)合力,究其原因是由于TP-Ⅰ中的色氨酸殘基插入LPS的疏水區(qū),而其陽離子殘基又與LPS的磷酸基團(tuán)相互作用,最終抑制LPS對(duì)蛋白酶原因子C的活化,起到抗微生物入侵作用;另外,TP-Ⅰ與LPS形成復(fù)合物既能穩(wěn)定TP-Ⅰ結(jié)構(gòu),又能引起磷脂分子在細(xì)胞膜中的翻轉(zhuǎn)及側(cè)移等運(yùn)動(dòng),保證在不形成穩(wěn)定通道的前提下使多肽分子穿過脂雙層[2]。

2.2 與細(xì)胞內(nèi)靶物質(zhì)的相互作用

TPs可通過改變生物膜通透性而進(jìn)入胞內(nèi),作用于胞內(nèi)的相關(guān)蛋白酶、RNA和基因組DNA等,從而抑制機(jī)體表達(dá)調(diào)節(jié)和相關(guān)代謝。Powers等[26]用生物素標(biāo)記polyphemusinⅠ,發(fā)現(xiàn)其大量積累在細(xì)胞質(zhì)中,但沒有引起細(xì)胞膜的破裂,推斷可能會(huì)與胞內(nèi)物質(zhì)作用。Ouyang等[27]表明,TP-Ⅰ可改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶、抗原等物質(zhì)的水平,并參與調(diào)節(jié)致癌相關(guān)基因的表達(dá)。有研究顯示,當(dāng)使用5 mg/L的TP-Ⅰ時(shí),大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)酯酶部分失活從而影響細(xì)胞活性;當(dāng)濃度達(dá)到80 mg/L時(shí),可導(dǎo)致大腸桿菌 DNA 斷裂[23,28～30]。

2.3 其他方面的作用

線粒體是細(xì)胞通過呼吸作用進(jìn)行能量代謝的場所,線粒體受損可直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。已有報(bào)道顯示,TPs抗菌肽能抑制細(xì)胞呼吸,將TPs與整聯(lián)蛋白R(shí)GD綴合形成RGD-TP肽,此肽能激活線粒體相關(guān)的caspase 9和caspase 3蛋白表達(dá),同時(shí)可破裂線粒體膜,最終抑制呼吸作用而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[31,32]。

TPs可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫作用,增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。在小鼠的抗感染模型滴鼻治療過程中,TP-Ⅰ可誘導(dǎo)小鼠分泌β-防御素2和胸腺肽,β-防御素2可抵御病原菌對(duì)機(jī)體的感染,而胸腺肽則可降低TNF-α、IL-6等促炎因子水平,提高 IL-2、IL-10等抗炎因子水平,兩者共同作用達(dá)到有效控制炎癥反應(yīng)目的[33]。除提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)因子水平外,TPs還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體以增加免疫力,如Feng等[34]應(yīng)用合成的TP-Ⅰ及其結(jié)構(gòu)類似物免疫小鼠,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)檢測獲得了TP-Ⅰ的相應(yīng)抗體。

3 TPs基因工程表達(dá)

重組TPs的研究最早開始于20世紀(jì)90年代,但商品化的鱟素產(chǎn)品至今尚未問世。近年來,Invitrogen公司研究開發(fā)的畢赤酵母表達(dá)試劑盒、表達(dá)及發(fā)酵操作手冊(cè)等一系列表達(dá)工具的應(yīng)用與推廣,使其成為除大腸桿菌、枯草桿菌、昆蟲細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)外,另一種技術(shù)成熟、表達(dá)穩(wěn)定、產(chǎn)量理想的外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。

目前,已經(jīng)有研究人員利用基因工程技術(shù)分別在畢赤酵母菌SMD1168、枯草桿菌Wb800以及大腸桿菌體系中成功表達(dá)出重組TP-Ⅱ、TP-Ⅰ和polyphemusinⅡ,重組TP-Ⅱ、TP-Ⅰ表達(dá)量最高分別可達(dá)150 mg/L、10 mg/L,對(duì)大腸桿菌 K12、K88具有較強(qiáng)抑殺效果,而重組polyphemusinⅡ?qū)ι抽T氏菌、金黃色葡萄球菌等表現(xiàn)出較好的抑制作用[11,14,35,36]。但在大腸桿菌體系表達(dá)的TPs多以包涵體形式存在,產(chǎn)物需要通過變性、復(fù)性等操作,下游處理難度加大,對(duì)蛋白酶非常敏感,易被水解[37]。此外,張鈁[36]采用改進(jìn)微量肉湯稀釋法測定天然polyphemusinⅡ?qū)δ袜Z酮類藥物的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的MIC值約為46～80 mg/L,而經(jīng)末端氨基酸改造后進(jìn)行重組表達(dá)的polyphemusinⅡ,對(duì)上述3種菌的MIC值約為15～30 mg/L,相對(duì)于天然polyphemusinⅡ,改造后的重組polyphemusinⅡ的MIC值較低,抑菌作用較強(qiáng)。高宇等[38]實(shí)現(xiàn)了TP-Ⅰ基因序列和人溶菌酶基因序列在畢赤酵母菌X-33體系內(nèi)的融合表達(dá),且融合蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923抑制效果明顯,這可為進(jìn)一步探索大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)融合蛋白提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。隨后該課題組進(jìn)一步展開研究,使用7.5 L發(fā)酵罐發(fā)酵得到了穩(wěn)定性好、表達(dá)量高的基因工程TP-Ⅰ表達(dá)菌株X-33,并對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行了摸索和優(yōu)化[39～41]。

至今,TPs的規(guī)模化生產(chǎn)還未能實(shí)現(xiàn)。本人所在課題組經(jīng)考察發(fā)現(xiàn),TP-Ⅰ對(duì)基因工程菌和微藻等均具有抑殺作用,即工程菌重組表達(dá)產(chǎn)物TP-Ⅰ可能會(huì)抑制自身菌體正常生長。因此,獲得高抗TPs的基因工程宿主細(xì)胞可能是破解TPs難以獲得高效表達(dá)難題的關(guān)鍵之一。

4 TPs發(fā)展應(yīng)用及瓶頸研究

隨著對(duì)TPs的研究進(jìn)一步加深,許多問題也不斷地暴露出來,如直接分離TPs工藝的復(fù)雜、化學(xué)合成技術(shù)不夠成熟且成本昂貴、基因工程表達(dá)重組TPs量低、大規(guī)模發(fā)酵工藝技術(shù)不成熟等等,研究人員在努力嘗試解決這些存在已久的問題的同時(shí),又發(fā)現(xiàn)了一些新的問題。

4.1 TPs的穩(wěn)定性

TPs抗菌肽與其他多肽相似,易被體內(nèi)蛋白酶降解而導(dǎo)致其不能穩(wěn)定存在于體內(nèi)[42]。TPs臨床應(yīng)用時(shí),由于在腸道及其他組織、血漿中存在大量的蛋白水解酶類,這些酶類可水解肽類藥物而導(dǎo)致其半衰期變短,因此TPs抗菌肽一般不進(jìn)行全身性應(yīng)用。為防止抗菌肽被外切酶水解,科研人員進(jìn)行了多方面探索,比如：對(duì)肽鏈的N端或C端進(jìn)行胺化修飾[43]或聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修飾[44],或是對(duì)酶切位點(diǎn)處進(jìn)行非天然D-氨基酸替換L-氨基酸設(shè)計(jì)[43]。此外,將線性多肽環(huán)化或用脂質(zhì)體包埋等方法也可以提高TPs對(duì)酶的耐受性,謝海偉等[45]以海藻酸鈉和殼聚糖為復(fù)合壁材料、以合成TPs多肽為芯材料制做微膠囊,通過實(shí)驗(yàn)證明微囊化TPs多肽具有較強(qiáng)的蛋白酶耐受性。

4.2 微生物對(duì)TPs的耐受可能性

相較于抗生素而言,抗菌肽最明顯的特征是不易引起細(xì)菌等微生物的抗藥性,因?yàn)榭咕姆N類多樣且作用靶點(diǎn)多,作用機(jī)制繁雜。但是最近的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌可對(duì)細(xì)胞膜等抗菌肽的作用靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾[46],表明抗菌肽也存在著耐受的可能性。目前,已經(jīng)確定金黃色釀膿葡萄球菌對(duì)防御素和一些人源抗菌肽等產(chǎn)生抗藥性[47]。

為了探討TP-Ⅰ作為臨床抗菌藥物的安全性問題,Hong等[48]利用TP-Ⅰ對(duì)嗜水氣單胞菌XS91-4-1、綠膿假單胞菌CGMCC 1.2620、大腸桿菌ATCC 25922等進(jìn)行長期協(xié)迫誘導(dǎo),結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著TP-Ⅰ濃度長期不斷增加,以上各種菌均對(duì)TP-Ⅰ表現(xiàn)出抗性;另外,經(jīng)長期UV誘變選擇下,綠膿假單胞菌和大腸桿菌同樣表現(xiàn)出對(duì)TP-Ⅰ的抗藥性,并且抗性突變體在抗生素(如：頭孢哌酮、阿米卡星)、TP-Ⅰ以及其他抗菌肽(如：抗菌肽 MSI78、TP-Ⅲ和polyphemusinⅠ)之間存在交叉抗藥性現(xiàn)象。存在TP-Ⅰ抗性突變體的主要機(jī)制可能與胞外蛋白酶介導(dǎo)的TP-Ⅰ降解有關(guān),但并不完全依賴于此機(jī)制,更深層次原因尚不明確;實(shí)驗(yàn)中的抗性突變體僅在長期不斷的特定條件誘導(dǎo)中產(chǎn)生,只能說明微生物對(duì)TP-Ⅰ有耐受的可能性,并不能有力地證明TP-Ⅰ易產(chǎn)生抗藥性菌,此結(jié)果可為TP-Ⅰ在各領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

4.3 TPs的細(xì)胞毒性

疏水性決定了TPs抗菌肽可以分配到脂質(zhì)雙層中的程度,因此疏水性是其重要的物理化學(xué)特征之一,但抗菌肽高度的兩親性和疏水性、緊密的折疊結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成細(xì)胞毒性。Kuzmin等[49]在比較非修飾的重組TP-Ⅰ和C-末端、N-末端修飾的合成TP-Ⅰ對(duì)腫瘤細(xì)胞抗性作用時(shí)發(fā)現(xiàn),修飾肽的半數(shù)溶血值HC50(50%紅細(xì)胞溶血所需肽的濃度)為90 μmol/L,而未修飾肽在該濃度范圍內(nèi)不具有溶血性,并且修飾肽對(duì)新鮮人血清中的蛋白水解酶的酶解作用具有抗性,說明末端修飾增加了其對(duì)腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞的非特異性毒性。Zhao等[50]通過一系列微陣列實(shí)驗(yàn)研究了TP-Ⅰ對(duì)斑馬魚遺傳方面的影響,從基因組水平上評(píng)估了TP-Ⅰ對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的細(xì)胞毒性,結(jié)果表明TP-Ⅰ對(duì)斑馬魚眼睛顯示毒副作用,且隨著TP-Ⅰ劑量的增加而增強(qiáng)。針對(duì)細(xì)胞毒性問題,可以通過氨基酸替換等方法進(jìn)行TPs結(jié)構(gòu)改造,以降低TPs分子的兩親性或疏水性。因此,抗菌肽分子結(jié)構(gòu)的改造和設(shè)計(jì)是創(chuàng)造高生物活力、低溶血活性TPs肽類藥物的有效途徑之一[42]。

4.4 生物活性新方向

生物膜(biofilm,BF)是微生物浮游菌類在長期進(jìn)化過程中所形成的,與浮游態(tài)菌完全不同的另一種生存方式,也是菌類更適應(yīng)環(huán)境壓力的一種生存表現(xiàn)。BF在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特性以及對(duì)藥物的敏感性等方面,均與浮游菌有明顯差異,因受到BF的保護(hù),膜內(nèi)層菌能夠逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)以及藥物的殺傷,從而易造成慢性、難治性感染[51,52]。相比浮游菌,BF具有高度耐藥性,其耐藥性是浮游菌的10 000倍[53]?？梢酝ㄟ^預(yù)防、對(duì)早期BF進(jìn)行藥物干擾等[54]方式來抑制其形成,對(duì)于已成形的BF,單用一種抗菌藥物很難將其完全清除,而不同種類藥物的聯(lián)合使用可降低單個(gè)藥劑濃度并達(dá)到協(xié)同作用,增加抗菌譜[55]。雖然上文已提到TP-Ⅰ的線性類似物與抗生素聯(lián)合使用,能明顯抑制銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌BF的形成,并且對(duì)于已經(jīng)形成24 h的BF也有一定作用效果[7,8],但關(guān)于TP-Ⅰ是否能單獨(dú)抑制BF的形成,對(duì)已成形的BF是否有破壞作用,以及TP-Ⅰ的使用方法等問題,目前很少有人提出,這些均需要不斷研究探索,需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

5 TPs抗菌肽的應(yīng)用與展望

TPs抗菌肽具有廣譜抗菌活性、相對(duì)較低的細(xì)胞毒性、與傳統(tǒng)抗生素不同的特殊抗菌機(jī)制等優(yōu)點(diǎn),使其成為一類極具潛力的肽類抗生素,在轉(zhuǎn)基因工程、臨床醫(yī)藥、食品工業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域均有著廣闊的應(yīng)用前景。TPs可作為一種全新型的肽類藥物應(yīng)用于臨床及醫(yī)藥工業(yè),用于解決抗生素存在的細(xì)菌抗藥性問題;也可作為水產(chǎn)和畜禽的飼料添加劑,提高禽類的生理功能,促進(jìn)其健康生長,同時(shí)減少畜禽、水產(chǎn)體內(nèi)的抗生素殘留;還可以作為優(yōu)良的防腐劑、保鮮劑應(yīng)用于食品工業(yè),制做功能性食品和保健營養(yǎng)品;而添加到日化用品中,具有殺菌消炎和促進(jìn)傷口愈合作用,可制做修復(fù)型化妝品。此外,利用基因工程把TPs的編碼基因序列轉(zhuǎn)入畜禽特定細(xì)胞或轉(zhuǎn)化農(nóng)作物,可培育出抗病新品種,這也是當(dāng)前國內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)[56～60]。

雖然TPs已在各個(gè)領(lǐng)域有了一定程度的應(yīng)用,但應(yīng)用中因自身結(jié)構(gòu)而可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性、體內(nèi)不穩(wěn)定性等問題還需要得到解決,其對(duì)細(xì)菌、真菌、腫瘤細(xì)胞、病毒、昆蟲等的作用機(jī)制也待進(jìn)一步深度研究,而且微生物對(duì)TPs可能存在的抗藥性問題也需要得到重視。另一方面,目前對(duì)TPs生物活性研究多是進(jìn)行體外試驗(yàn),而體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)的給藥劑量與濃度、藥理學(xué)、毒理性和藥代動(dòng)力學(xué)等方面也需要進(jìn)一步研究。因此,要綜合考慮各方面因素的影響,才有望開發(fā)設(shè)計(jì)出高生物活性、低細(xì)胞毒性且不易耐受的肽類新藥物,降低不斷出現(xiàn)的致病微生物對(duì)人類健康的威脅,為人類的生活服務(wù)。