吳 邊,柳陳堅(jiān),李雅迪,尚 云,李曉然*

(1.云南省第一人民醫(yī)院普外二科,中國云南昆明650032;2.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外二科，中國云南昆明650032;3.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,中國云南昆明650500)

物質(zhì)生活水平的不斷提高改變了人類的飲食方式,高蛋白質(zhì)高脂肪的飲食給人類健康帶來了越來越多的負(fù)面影響。其中,心腦血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的一大重要因素[1]。血清膽固醇含量過高被認(rèn)為是誘發(fā)高血壓、冠心病等心血管疾病的重要因素,降低血清膽固醇水平直接關(guān)系到人類的健康水平[2,3]。目前,常用的降固醇藥物可以有效降低血管中的膽固醇含量[4]。例如,他汀類藥物能有效抑制體內(nèi)膽固醇的從頭合成途徑,已被廣泛應(yīng)用于臨床治療。然而他汀類藥物在臨床上依然存在著一定比例的副作用和不確定性,尤其是在高劑量使用時(shí)[5]。例如,他汀類藥物可導(dǎo)致橫紋肌溶解癥與肝臟細(xì)胞損傷,進(jìn)而破壞機(jī)體內(nèi)新陳代謝系統(tǒng)的功能[6]。因此,找尋可以增加治療范圍且毒副作用小的方法勢(shì)在必行。

國內(nèi)外大量研究表明,某些益生菌可有效降低生存環(huán)境中的膽固醇含量,且因其副作用小等優(yōu)點(diǎn)一直以來成為益生菌相關(guān)研究的熱點(diǎn),然而大多數(shù)研究均集中于乳桿菌屬[7,8],對(duì)腸球菌屬的研究相對(duì)較少。Divyashri等[9]研究證明,Enterococcus faecium CFR 3003菌株在模擬胃腸道環(huán)境下,具有良好的生存能力和生化特性,但未對(duì)該菌株是否具有降膽固醇能力進(jìn)行深入研究。

本研究首先檢測(cè)了22株分離自云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品的屎腸球菌(E.faecium)的降膽固醇能力,并從中篩選出3株降膽固醇能力較佳的菌株,分析其耐酸耐膽鹽能力、溶血性能、對(duì)抗生素的敏感程度、膽鹽水解酶活性,以初步分析其膽固醇降解機(jī)制,為后續(xù)降膽固醇功能性發(fā)酵食品的研發(fā)提供菌種保證和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所使用的22株屎腸球菌現(xiàn)均保藏于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院應(yīng)用微生物研究室。

實(shí)驗(yàn)用主要培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基(pH 6.2±0.2,OXOID公司,英國);MRS改良培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基以膽固醇代替葡萄糖作為培養(yǎng)基中唯一碳源,膽固醇濃度為0.192 mg/mL,其余MRS培養(yǎng)基組分和比例不變;MH培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司);BHI培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

實(shí)驗(yàn)用主要試劑：膽固醇(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);甲醇(色譜純,美國MREDA公司;分析純,東營天正化工有限公司);濃硫酸(重慶川東化工集團(tuán)有限公司);牛膽鹽(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);無菌脫纖維羊血(廣州蕊特生物科技有限公司);異丙醇(天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);甘氨膽酸鈉(上海源葉生物科技有限公司);?；悄懰徕c(TCI公司,日本)。

實(shí)驗(yàn)用主要溶液：FeSO4-冰乙酸-濃硫酸顯色劑,將FeSO4100 mg溶于1 mL蒸餾水中,再加入100 mL冰乙酸混合溶解,然后與100 mL濃硫酸緩慢混勻,冷卻后備用;膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液,精確秤取0.192 g膽固醇,用蒸餾水定容至1 L,即得濃度0.192 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液,然后梯度稀釋得濃度依次為 0 mg/mL、0.048 mg/mL、0.096 mg/mL、0.144 mg/mL、0.192 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液;甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液,精確稱取0.004 9 g甘氨膽酸鈉溶解于10 mL的甲醇中,即得濃度為1 mmol/L目標(biāo)溶液,然后梯度稀釋得濃度依次為0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫?fù)u床(ZHWY-200D,上海智誠分析儀器有限公司);電子分析天平(SI-234,Sartorius公司,德國);超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(SCIENTZ-IID,寧波新芝生物科技股份有限公司);PCR儀(PCR system 2720,ABI公司,新加坡);高速冷凍離心機(jī)(3-18K,Sigma公司,德國);紫外分光光度計(jì)(GENOVA公司,英國);恒溫水浴槽(KTS-2346 AS ONE,日本);YP-1002N電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);金屬浴(FUNAKOSHI公司,日本);HPLC儀和反相柱(Agilent Technologies Inc.,美國)。

1.3 方法

1.3.1 菌株復(fù)壯

將菌株用MRS液體培養(yǎng)基復(fù)壯兩次后,當(dāng)各菌株活菌數(shù)達(dá)到1012cfu/mL時(shí),按4‰接種量將菌株接種至特定的MRS液體培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)至所需的時(shí)間。

1.3.2 降膽固醇功能性屎腸球菌的測(cè)定

利用略作改良的皂化-比色法[10]對(duì)22株屎腸球菌的降膽固醇能力進(jìn)行檢測(cè)。將復(fù)壯后的菌株接種至50 mL MRS改良培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)72 h,然后按照皂化-比色法處理并于490 nm波長下測(cè)定被測(cè)樣品的OD值。同法處理膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液,以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,最終根據(jù)被測(cè)樣品的吸光度值計(jì)算樣品中膽固醇含量,并以公式計(jì)算被測(cè)菌株的膽固醇去除率：Rc=(a-b)/a×100%,其中a表示培養(yǎng)基初始培養(yǎng)時(shí)的膽固醇濃度,b表示培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)液中膽固醇濃度。從得到的結(jié)果中,篩選出3株降解能力較佳的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.3 屎腸球菌耐酸和耐膽鹽能力的檢測(cè)

利用平板計(jì)數(shù)法對(duì)3株屎腸球菌的耐酸能力進(jìn)行檢測(cè),具體操作步驟參照已有文獻(xiàn)[11]進(jìn)行：將復(fù)壯后的菌株接種至pH分別為2.0和3.0的新鮮MRS液體培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)3 h。在0 h、1 h、2 h、3 h時(shí)間點(diǎn)分別吸取100 μL菌液調(diào)節(jié) pH至6.2(與MRS培養(yǎng)基相同)后涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上,37℃靜置培養(yǎng)24 h左右,記錄菌落數(shù)。

耐膽鹽能力檢測(cè)同上,即復(fù)壯后的菌株分別接種至含不同膽鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中,膽鹽質(zhì)量濃度分別為：0.3%、0.5%、1%,靜置培養(yǎng)后涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng),記錄菌落總數(shù),不含有膽鹽的無菌水作為空白對(duì)照。

1.3.4 屎腸球菌膽鹽水解酶(bile salt hydrolase,BSH)活性的檢測(cè)

利用高效液相色譜法檢測(cè)3株屎腸球菌的BSH活性[12]。樣品前處理方法如下：將復(fù)壯后的菌株接種至含有1 mmol/L的甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c的新鮮MRS液體培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)24 h后,在1 mL樣品中加入6 mol/L HCl使樣品酸化(終止BSH活性反應(yīng))。甘氨膽酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)品被測(cè)定。在1 mL樣品中加入4 mL異丙醇,充分混勻10 min,然后在11 641 r/min下離心10 min,隨后將4 mL上層有機(jī)相移至干凈的試管內(nèi),在85℃下蒸發(fā)溶劑,隨后將膽鹽提取物重新溶解在800 μL甲醇中,再用0.45 μm過濾器過濾,保存在-20℃以備后續(xù)檢測(cè)。

色譜條件：溶劑A為HPLC專用甲醇;溶劑B為0.01 mol/L乙酸鈉(用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.3),含有65%甲醇。流動(dòng)相為35%溶劑A和65%溶劑B,無梯度洗脫,流速為1 mL/min。注射樣品：10 μL,紫外線波長檢測(cè)為202 nm;保留時(shí)間為10 min。以甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終根據(jù)被測(cè)樣品的峰面積計(jì)算培養(yǎng)基中甘氨膽酸鈉的含量,并以公式計(jì)算檢測(cè)菌株對(duì)甘氨膽酸鈉的降解率：Rs=(c-d)/c×100%,其中c表示培養(yǎng)基初始培養(yǎng)時(shí)的甘氨膽酸鈉濃度,d表示培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基中甘氨膽酸鈉濃度。

1.3.5 屎腸球菌降膽固醇能力的檢測(cè)

在含有膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3株屎腸球菌,利用略作改良的皂化-比色法檢測(cè)其降解膽固醇的能力。然后將復(fù)壯后的菌株接種至50 mL膽鹽濃度為0.3%的 MRS改良培養(yǎng)基中,在37℃下靜置培養(yǎng)72 h后,利用皂化-比色法測(cè)定培養(yǎng)基上清液中膽固醇的含量,從而測(cè)定菌株降解膽固醇的能力是否發(fā)生改變。

1.3.6 屎腸球菌的安全性評(píng)估

屎腸球菌溶血性試驗(yàn)[13]：將復(fù)壯后的菌株按平板法接種于含5%的無脫纖維蛋白羊血的BHI培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)48 h,隨后觀察菌株的溶血情況。金黃色葡萄球菌作為陽性對(duì)照。

屎腸球菌抗藥性檢測(cè)：利用略作改良的瓊脂擴(kuò)散法(NCCLS 2003)檢測(cè)屎腸球菌的抗藥性。具體步驟如下：取復(fù)壯后的菌液1 mL離心,得到菌體沉淀,用無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀2次后,重新懸浮菌液。然后,取適量的菌液按平板法涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基中。待平板凝固后用無菌鑷子取藥敏紙片貼于平板表面,37℃培養(yǎng)24 h后,測(cè)量抑菌圈直徑。以大腸埃希菌ATCC 25922(菌株保藏于昆明理工大學(xué)應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室)作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2010及RSD值計(jì)算統(tǒng)計(jì)軟件處理,所得平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差均由兩個(gè)以上樣品的測(cè)量結(jié)果經(jīng)計(jì)算得到,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 屎腸球菌降解膽固醇的能力

以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo),490 nm下的吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析,得線性回歸方程 y=1.792x+1.45×10-6,R=0.999 (R2=0.999 7)。如表1所示,這22株屎腸球菌均具有體外降解膽固醇的能力,其降解能力為85.93%～21.25%。其中SP5-6L菌株的體外降解率高達(dá)85.93%,與其他研究菌株相比,具有一定的膽固醇降解優(yōu)勢(shì)。

為了探討上述菌株在體內(nèi)應(yīng)用的可能性,對(duì)其進(jìn)行了耐酸耐膽鹽試驗(yàn)。其中,多數(shù)菌株在膽鹽條件下不能很好的生存。故文中主要選取在膽鹽條件下生長良好的3株菌(SP5-6L、JS2和ML13-5)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SP5-6L菌株在含有膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中膽固醇降解率為45.55%,與之前不含膽鹽時(shí)的降解率相比,顯著降低(圖1),這可能是因?yàn)樵摼觌m然可以耐受一定濃度的膽鹽,但是其生長還是受到膽鹽的影響,所以在培養(yǎng)過程中,活菌數(shù)也顯著減少,從而造成其膽固醇降解率大幅度降低。而JS2菌株與ML13-5菌株在膽鹽存在情況下,雖然其膽固醇去除率有一定升高,但漲幅不明顯(圖1)。Ilavenil等[14]的研究表明,戊糖小球菌KCC-23菌株在含有0.3%膽鹽培養(yǎng)時(shí),其膽固醇的去除率可達(dá)到70%左右。這與本文結(jié)果并不一致,可見,本研究中3株菌降解膽固醇的原理可能并不是通過BSH催化膽鹽由結(jié)合型轉(zhuǎn)變成游離型進(jìn)而沉淀膽固醇,具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

表1 屎腸球菌降解膽固醇能力Table1 The cholesterol-reducing ability of 22 E.faecium strains

圖1 培養(yǎng)基中有無膽鹽對(duì)3株菌株降解膽固醇能力的影響Fig.1 Influence of the bile salt on the cholesterol-reducing ability of the probiotics

2.2 屎腸球菌耐酸耐膽鹽能力和BSH活性

通過在培養(yǎng)基中添加不同的酸和膽鹽濃度來探討酸和膽鹽對(duì)這3株菌生長的影響。在前述結(jié)果(表1)中,SP5-6L菌株具有最高的膽固醇去除率(85.93%),但是進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示：其無法耐受酸的影響,膽鹽濃度也會(huì)影響其生長,log cfu/mL值由13.03降到7.56(表2)。另外兩株菌的生長也受到酸和膽鹽的一定影響,在pH 3.0以及不同的膽鹽濃度下,JS2菌株的活菌數(shù)降低至50%左右;ML13-5菌株受到酸的影響要大于膽鹽,在酸性條件下,其活菌數(shù)大約下降至50%左右,而在不同濃度的膽鹽下,活菌數(shù)還能有原來的70%以上(表2)。在Mandal等[15]的研究中,乳酸片球菌的生長也受到酸的影響,說明體內(nèi)較低的pH還是會(huì)對(duì)益生菌造成較大影響。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,細(xì)菌中存在幾種膽固醇降解機(jī)制,其中一種機(jī)制是膽固醇的溶解度取決于膽鹽的溶解度,菌株的BSH可以催化結(jié)合型膽鹽轉(zhuǎn)變成游離性膽鹽,而后者可以與甘氨膽酸鈉或?；悄懰徕c結(jié)合形成沉淀,并由糞便排出體外,從而降低膽固醇含量[15]。這提示,甘氨膽酸鈉的含量變化可以從側(cè)面反映菌株BSH活性的變化。表3的結(jié)果顯示,在SP5-6L、JS2、ML13-5這3種菌株培養(yǎng)后培養(yǎng)基中的甘氨膽酸鈉濃度大大降低,由1 mmol/L降低到0.28±0.05 mmol/L,由此證明這3株菌具有較強(qiáng)的BSH活性。Anandharaj等[16]研究證實(shí)乳桿菌屬的菌株在含有甘氨膽酸鈉的環(huán)境培養(yǎng)后,甘氨膽酸鈉的濃度也從6 mmol/L降低至1.25±0.12 mmol/L,由此證實(shí)這3株屎腸球菌具有BSH活性,且在膽鹽存在條件下,仍然具有一定的水解活性。

表2 屎腸球菌的耐酸耐膽鹽能力(log cfu/mL)Table2 Acid and bile salt tolerance of E.faecium strains(log cfu/mL)

表3 屎腸球菌中膽鹽的溶解度Table3 The activity of BSH of probiotics

2.3 屎腸球菌的安全性

溶血性試驗(yàn)表明,文中所選3種屎腸球菌均無溶血性,都不會(huì)引起紅細(xì)胞破裂,也不會(huì)產(chǎn)生溶血環(huán),說明這3株菌不產(chǎn)生溶血素,對(duì)人體相對(duì)安全(圖2)。

屎腸球菌對(duì)抗生素的敏感性測(cè)試結(jié)果表明,這3株菌對(duì)萬古霉素、諾氟沙星具有抗性,SP5-6L菌株和JS2菌株對(duì)鏈霉素、慶大霉素具有敏感性。此外,SP5-6L菌株對(duì)氨芐青霉素具有抗性,而對(duì)其他5種抗生素表現(xiàn)為中間抗性;JS2菌株對(duì)四環(huán)素具有敏感性,對(duì)利福平具有抗性,而對(duì)其他4種抗生素表現(xiàn)為中間抗性;ML13-5菌株對(duì)氨芐青霉素具有敏感性,對(duì)鏈霉素表現(xiàn)為中間抗性,而對(duì)其他6種抗生素具有抗性(表4)。

圖2 三株屎腸球菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)的細(xì)菌溶血試驗(yàn)Fig.2 The hemolysis of the three E.faecium strains(A)and the Staphylococcus aureus strain(B)

表4 屎腸球菌的抗藥性Table4 The antibiotic resistance of E.faecium

3 結(jié)論

心腦血管疾病一直以來威脅著人類健康,探索其有效的預(yù)防和治療方法迫在眉睫。經(jīng)過半個(gè)世紀(jì)的研究和探討,已有充分的證據(jù)證明乳酸菌可以有效降低動(dòng)物或人體膽固醇水平[17～19]。目前提出的乳酸菌降低膽固醇的作用機(jī)制假說之一是：細(xì)菌產(chǎn)生的BSH催化結(jié)合型膽鹽轉(zhuǎn)變成游離型膽鹽,后者與膽固醇結(jié)合以沉淀形式排出體外,從而達(dá)到降低人體內(nèi)膽固醇水平的目的[7,20,21]。

本研究所選用的22株屎腸球菌具有不同程度的體外降解膽固醇能力(表1)。根據(jù)膽鹽耐受能力選取3株菌進(jìn)行進(jìn)一步研究,結(jié)果顯示,所選用的3株屎腸球菌都有較強(qiáng)的BSH活性(表3),表明傳統(tǒng)發(fā)酵食品中可能存在大量具有膽固醇降解能力的屎腸球菌及其他種益生菌,在對(duì)這些菌株進(jìn)行系統(tǒng)研究后開發(fā)具有降膽固醇能力的健康食品是非常有必要的。

在模擬胃酸環(huán)境下,SP5-6L菌株幾乎無法生長,由此證明該菌株耐酸能力較差,而JS2菌株與ML13-5菌株的活菌數(shù)雖然較初始培養(yǎng)時(shí)減少一半(表2),但還是可以證明這兩株菌具有一定的耐酸性,在體內(nèi)有潛力通過胃酸的極端環(huán)境而到達(dá)腸道。SP5-6L菌株耐膽鹽能力較差(表2),這可能是由于BSH催化膽鹽變成膽汁酸,降低了培養(yǎng)基中的pH(培養(yǎng)后pH為4.3),而SP5-6L菌株的耐酸能力較差,這樣活菌數(shù)顯著減少,膽固醇的去除率也隨之降低。此外,在培養(yǎng)基中添加膽鹽后發(fā)現(xiàn),JS2菌株的膽固醇去除率無任何變化,而ML13-5菌株的去除率則增長16%,可能的原因是：屎腸球菌可以產(chǎn)生一定的有機(jī)酸,在酸性條件下,膽固醇與膽汁鹽共沉淀使得膽固醇水平降低[22]。

腸球菌在食物防腐和發(fā)酵方面發(fā)揮關(guān)鍵作用,而且可在人體和哺乳動(dòng)物的腸道中產(chǎn)生益生元[23],但是該菌種有時(shí)也會(huì)引發(fā)一些人類疾病,諸如菌血癥、心內(nèi)膜炎等感染病癥[9,24]。因此,本文對(duì)SP5-6L、JS2、ML13-5這3株菌實(shí)施了溶血性試驗(yàn)和抗藥性測(cè)試。結(jié)果證明這3株菌無溶血性,但是它們對(duì)10種抗生素的敏感性不盡相同,其中,ML13-5菌株對(duì)10種抗生素都具有一定抗藥性。因此,雖然本研究對(duì)這些菌株的安全性做了相應(yīng)試驗(yàn),但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能說明這些菌株能作為食品或藥品發(fā)酵菌株投入到相應(yīng)的生產(chǎn)中。待今后對(duì)其危害性進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估后才能考慮是否可將這些菌株投入到相應(yīng)的生產(chǎn)應(yīng)用中。