薩如拉,席領(lǐng)軍,盧 萍,高 峰,杜 玲

(內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,中國內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特010022)

小花棘豆(Oxytropis glabra DC.)是豆科(Leguminosae sp.)棘豆屬(glabra DC.)多年生草本植物,主要生長于鹽漬化低濕草甸草原[1]。Colegate等[2]首次從灰苦馬豆(Swainsona canescens)中分離出苦馬豆素(swainsonine,SW),其分子式是C8H15NO3,相對分子質(zhì)量為173,可抑制動(dòng)物細(xì)胞甘露糖苷酶的活性,引起低聚糖代謝和糖蛋白合成障礙,導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官功能紊亂。國際上將含SW的棘豆屬和黃芪屬植物稱為瘋草,小花棘豆屬于瘋草的一種。家畜過量采食含SW的瘋草會(huì)發(fā)生中毒,出現(xiàn)四肢麻痹、不孕、不育、流產(chǎn)等現(xiàn)象,嚴(yán)重者甚至?xí)劳?給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[3,4]。然而SW具有良好的抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性。劉柄亞等[5]用SW開展人胃癌生長及轉(zhuǎn)移的抑制實(shí)驗(yàn)證明其具有腫瘤抑制作用。Goss等[6]將SW用于臨床試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)SW對腫瘤患者的治療有效。此外,相關(guān)研究指出SW也可用于白血病、喉癌、食管癌、肺癌及胃癌等的治療[7～11]。SW的分子結(jié)構(gòu)為雙雜環(huán),有4個(gè)手性構(gòu)型,在人工合成過程中易形成手性異構(gòu)體,難以區(qū)分,故人工合成SW價(jià)格昂貴,而利用生物體(植物、真菌等)自身合成SW,可顯著提高合成效率[12,13]。

Braun等[14]首次從美國3種瘋草絹毛棘豆(Oxytropis sericea)、密柔毛黃芪(Astragalus mollisimus)和蘭伯氏棘豆(Oxytropis lambertii)中分離到產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌,將其鑒定為Embellisia,之后有學(xué)者將其修訂為Undifilum[15],而后又有學(xué)者將其歸于Alternaria屬,命名為Undifilum oxytropis[16]。盧萍等[17,18]從小花棘豆體外培養(yǎng)出內(nèi)生真菌,發(fā)現(xiàn)其合成了SW,經(jīng)形態(tài)學(xué)與DNA鑒定將其歸到Embellisia屬。目前小花棘豆內(nèi)生真菌被修訂為Alternaria oxytropis,有該內(nèi)生真菌的小花棘豆產(chǎn)SW,無該內(nèi)生真菌的小花棘豆則檢測不到SW。

Mukherjee等[19]提出在 Undifilum oxytropis中SW合成代謝的部分途徑可能為：由α-氨基己二酸可生成賴氨酸和SW(圖1),在該代謝途徑中具體細(xì)節(jié)尚未清楚。

近期Ren等[20]通過基因組學(xué)研究,推測在Undifilum oxytropis內(nèi)生真菌中由賴氨酸合成SW可能存在P2C和P6C兩種途徑(圖2)。由于這兩條途徑是通過基因組學(xué)研究推測的,具體細(xì)節(jié)及參加反應(yīng)的酶尚不完全清楚。

圖1 Undifilum oxytropis中SW合成途徑[19]Fig.1 SW synthesis pathway in Undifilum oxytropis[19]

圖2 Alternariasect.Undifilumoxytropis中SW合成途徑[20]Fig.2 SW synthesis pathway in Alternaria sect.Undifilum oxytropis[20]

本課題組前期已經(jīng)克隆到小花棘豆內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶cDNA(KJ944635)和基因(KY-052048),構(gòu)建了基因缺失載體,并將載體轉(zhuǎn)化至OW7.8原生質(zhì)體中再生,篩選到酵母氨酸還原酶基因缺失突變株M1?，F(xiàn)以酵母氨酸還原酶基因缺失突變株M1和野生株OW7.8為研究對象,通過在培養(yǎng)基中添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、賴氨酸和哌啶酸等前體物,比較不同培養(yǎng)時(shí)間下內(nèi)生真菌野生株和突變株中SW合成動(dòng)態(tài)變化,探索酵母氨酸還原酶基因?qū)W合成動(dòng)態(tài)的影響,為研究酵母氨酸還原酶基因?qū)π』箖?nèi)生真菌中SW合成代謝途徑的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

OW7.8和M1由本實(shí)驗(yàn)室提供。SW標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購自西北農(nóng)林科技大學(xué),酵母氨酸、α-氨基己二酸、賴氨酸、哌啶酸、乙酸銨產(chǎn)自美國Sigma公司,樹脂產(chǎn)自Alfa Aesar公司,瓊脂產(chǎn)自Coolaber公司,蔗糖、乙酸、氨水產(chǎn)自天津市化學(xué)試劑三廠,色譜純甲醇產(chǎn)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 培養(yǎng)基配制

對照組培養(yǎng)基(馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基,PDA)：稱取200 g馬鈴薯,切成小塊放入燒杯,加超純水至1 000 mL,煮沸20 min,用4層紗布過濾除去馬鈴薯殘?jiān)?加入20 g蔗糖攪拌溶解,加超純水至1 000 mL,分裝至錐形瓶,分別加入質(zhì)量濃度為1.5%的瓊脂,121℃濕溫高壓滅菌20 min。

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基：在上述PDA培養(yǎng)基中添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、L-賴氨酸和哌啶酸溶液。課題組前期研究中在培養(yǎng)基中添加化合物終濃度為1×10-4μg/mL時(shí),內(nèi)生真菌SW含量最高,故本研究選擇了該濃度。

1.3 內(nèi)生真菌培養(yǎng)及SW提取

將野生型菌株OW7.8和酵母氨酸還原酶基因缺失菌株M1接種至PDA培養(yǎng)基活化,分別用打孔器切成菌餅,接種于對照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基上,于25℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)至第14 d后每隔3 d取一次樣,直至第38 d,烘干稱重。每組做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

參照李莎等[8]的方法提取SW：將以上樣品置研缽加液氮研磨,轉(zhuǎn)入滅菌離心管中,加乙酸和氯仿,置機(jī)械旋轉(zhuǎn)儀80 r/min提取12 h。將提取液離心,抽取上清液至提取管,于80 r/min旋轉(zhuǎn)提取20 min。重復(fù)上述步驟。提取管加無菌超純水顛倒混勻,洗滌陽離子交換樹脂,棄去溶液,重復(fù)兩次。提取管中加氨水,80 r/min旋轉(zhuǎn)混勻20 min,使樹脂上的SW溶于氨水中,收集提取管液體,置真空離心濃縮儀濃縮至粉末狀備用。

1.4 內(nèi)生真菌中SW含量檢測

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)條件：以5%(V/V)甲醇和20 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相(用滅菌超純水配制),流速為0.4 mL/min,C18柱洗脫,檢測母離子數(shù)為156,子離子數(shù)為70,collision energy=119,CE=30,進(jìn)樣量為 2 μL,柱溫為30℃。

SW標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取SW標(biāo)準(zhǔn)品,用滅菌超純水配制濃度分別為 4.95 μg/mL、2.47 μg/mL、1.24 μg/mL、0.62 μg/mL、0.31 μg/mL 的溶液,按濃度由低至高依次進(jìn)樣,利用HPLC-MS技術(shù)檢測,用Agilent Mass Hunter定量分析軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析,以SW濃度為橫坐標(biāo)、液相色譜265 nm處吸收峰響應(yīng)值×103為縱坐標(biāo)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

內(nèi)生真菌中SW含量的檢測：在上述樣品中加入1 mL滅菌超純水,用0.22 μm針筒式濾膜過濾器過濾除菌,利用HPLC-MS技術(shù)對樣品進(jìn)行檢測,用Agilent Mass Hunter定量分析軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 21.0軟件對同一天不同處理的真菌SW含量進(jìn)行單因素方差分析及差異顯著性分析,其中根據(jù)處理間方差是否具有齊性,用Duncan或Tamhane’s T2方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1 239.118 81x-155.677 276,其相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 98,線性關(guān)系良好(圖3),儀器穩(wěn)定可用于后續(xù)樣品中SW含量檢測。SW標(biāo)準(zhǔn)品在高效液相色譜中峰值為0.869 min,在高效液相色譜里以0.586～1.609 min的保留時(shí)間被洗脫。

2.2 內(nèi)生真菌SW合成的動(dòng)態(tài)變化

在對照組中,OW7.8中SW含量明顯高于M1,且在不同時(shí)間點(diǎn)OW7.8和M1內(nèi)SW含量不同,呈先升高后下降趨勢。OW7.8中SW含量在第14 d時(shí)為 0.733 mg/g,第 14～26 d 緩慢增加,第26～29 d迅速上升,在第29 d達(dá)到最高值1.717 mg/g,第29～32 d迅速下降,之后逐漸降低至0.425 mg/g;M1中SW含量第14 d時(shí)為0.010 mg/g,第14～20 d增加緩慢,第20～23 d迅速上升,在第23 d時(shí)達(dá)到最高值0.204 mg/g,第23～32 d逐漸降低至0.020 5 mg/g(圖4)。

圖3 SW標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of SW content

圖4 對照組野生型菌株OW7.8和突變株M1內(nèi)SW合成動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of SW synthesis in the CK groups of wild type OW7.8 and mutant M1

培養(yǎng)基內(nèi)添加不同化合物對野生株OW7.8內(nèi)SW合成動(dòng)態(tài)變化均有不同的影響,添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、賴氨酸和哌啶酸后,在第14 d真菌SW含量分別為0.756 mg/g、0.137 mg/g、0.003 mg/g和0.112 mg/g,14 d后均出現(xiàn)SW含量上升。其中,添加酵母氨酸后,在第26 d真菌SW含量達(dá)最高值1.174 mg/g;添加α-氨基己二酸后,在第26 d達(dá)最高值5.819 mg/g;添加賴氨酸后,在第23 d達(dá)最高值7.387 mg/g;而添加哌啶酸后,在第32 d達(dá)最高值19.547 mg/g,明顯高于其他3組(圖5、表1)。以上結(jié)果提示哌啶酸的影響最大。

以添加化合物為自變量、OW7.8中SW合成量最高值為因變量,進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果顯示添加化合物對OW7.8的SW合成有顯著影響(P＜0.01)。

圖5 添加不同化合物后野生型菌株OW7.8的SW含量動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of SW synthesis in wild type OW7.8 groups with different precursor addition

在培養(yǎng)基內(nèi)添加不同化合物對M1內(nèi)SW合成動(dòng)態(tài)變化也均有不同的影響,哌啶酸和賴氨酸的影響比酵母氨酸和α-氨基己二酸大。添加酵母氨酸、α-氨基己二酸、賴氨酸和哌啶酸后突變株M1內(nèi)SW含量在第14 d時(shí)分別為1.096 mg/g、0.333 mg/g、2.405 mg/g、0.028 mg/g,之后均上升。其中,添加酵母氨酸后在第20 d達(dá)最高值1.256 mg/g;添加α-氨基己二酸后,在第17 d達(dá)最高值0.408 mg/g;而添加賴氨酸和哌啶酸后,分別在第20 d、26 d達(dá)最高值7.979 mg/g和8.837 mg/g,最高值明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組和對照組(圖6、表1)。

以添加化合物為自變量、M1中SW合成量最高值為因變量,進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果顯示添加化合物對M1的SW合成有顯著影響(P＜0.01)。

圖6 添加不同化合物后酵母氨酸還原酶基因缺失突變株M1內(nèi)SW含量動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of SW synthesis in mutant M1 groups with different precursor addition

在培養(yǎng)基中添加不同前體化合物均對OW7.8、M1的SW合成變化有不同影響。添加酵母氨酸后,OW7.8和M1內(nèi)SW含量在第14～20 d均處于上升期,第20 d時(shí)M1中SW含量達(dá)最高值,而OW7.8中SW含量繼續(xù)上升,第23 d后OW7.8內(nèi)SW含量均高于M1;添加哌啶酸后,在前23 d OW7.8內(nèi)SW含量低于M1,而從第23 d開始進(jìn)入快速上升期,其后SW含量均高于M1;添加賴氨酸后,OW7.8和M1內(nèi)SW含量在第14～20 d均處于上升期,而在第20～23 d OW7.8內(nèi)SW含量進(jìn)入快速上升期、M1內(nèi)SW含量則進(jìn)入快速下降期,第23 d后OW7.8內(nèi)SW含量均高于M1;添加α-氨基己二酸后,OW7.8內(nèi)SW含量基本均高于 M1(圖7、表 1)。

表1 添加不同化合物后野生型菌株OW7.8和突變株M1內(nèi)SW含量(mg·g-1)Table1 Contents of SW in wild type OW7.8 and mutant M1(mg·g-1)

取內(nèi)生真菌SW含量最高值,以2菌株(基因型)和添加化合物為自變量,內(nèi)生真菌中SW合成量為因變量,2個(gè)因素不同水平(菌株2個(gè)水平、添加化合物4個(gè)水平)進(jìn)行多因素方差分析,結(jié)果顯示菌株(基因型)、添加化合物對內(nèi)生真菌SW合成有顯著影響(P＜0.01)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),野生株OW7.8的SW含量高于突變株M1。推測賴氨酸是生物必需氨基酸,酵母氨酸是賴氨酸合成的前體物,敲除酵母氨酸還原酶基因后M1內(nèi)酵母氨酸合成受阻,需從逆反應(yīng)方向由P6C轉(zhuǎn)化成酵母氨酸,P6C是SW的前體物,因而M1中SW含量減少。酵母氨酸、賴氨酸、哌啶酸和α-氨基己二酸是內(nèi)生真菌合成SW的前體物,培養(yǎng)基中添加前體,OW7.8和M1的SW合成量高于對照,說明4種前體物均可促進(jìn)SW合成,其中哌啶酸較其他前體物促進(jìn)作用更強(qiáng),推測哌啶酸是SW合成的直接前體,故對合成量影響大。

酵母氨酸還原酶基因缺失突變株M1是賴氨酸合成缺陷型,添加賴氨酸后不僅滿足了真菌對賴氨酸的基本需求,而且其余的賴氨酸可用來合成SW,故賴氨酸的添加對突變株中SW含量變化的影響比野生型大;酵母氨酸是賴氨酸合成的前體,對野生株和突變株添加酵母氨酸一方面可滿足真菌合成賴氨酸的基本需求,另一方面多余的酵母氨酸可在酵母氨酸氧化酶的作用下生成P6C,而P6C是SW合成的前體,使OW7.8和M1的SW合成量增加。

楊國棟[21]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加L-賴氨酸和L-哌啶酸均可促進(jìn)SW合成,與本研究結(jié)果相同。Mukherjee等[19]提出酵母氨酸還原酶基因影響Undifilum oxytropis內(nèi)生真菌SW的合成,但基因敲除突變株的酵母氨酸和賴氨酸含量減少,SW和P6C含量增加,與本研究結(jié)果不盡相同。由于本研究結(jié)果是基于內(nèi)生真菌SW合成的動(dòng)態(tài)變化得出的,推測Mukherjee等的結(jié)果可能只反映了真菌生長特定時(shí)刻SW合成的情況。

圖7 添加不同化合物后野生型菌株OW7.8和突變株M1中SW含量動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Dynamic changes of SW synthesis in wild type OW7.8 and mutant M1

本研究結(jié)果為研究內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因?qū)W合成的影響奠定了基礎(chǔ),對合理利用小花棘豆以及在醫(yī)藥領(lǐng)域利用SW有重要意義。