曹金虎，王令冉，羅靜波，俞海東，韓榮勛

(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州434025)

禽蛋類(lèi)是我國(guó)人民膳食蛋白質(zhì)的重要來(lái)源。其中，雞蛋的蛋白質(zhì)生理價(jià)值最高，也是人們?nèi)粘Ｊ秤米疃嗟牡邦?lèi)。雞蛋的蛋白質(zhì)生理價(jià)值高達(dá)94，而牛奶、牛肉、豬肉分別為85、76和74。雞蛋的蛋清由約87%的水、11%的蛋白質(zhì)、微量的脂質(zhì)以及少量的礦物質(zhì)和維生素等組成；而蛋黃由約51%的水、31%的脂肪、17%的蛋白質(zhì)、少量礦物質(zhì)以及多種維生素等組成[1]。然而，不同的加工方法會(huì)導(dǎo)致雞蛋中的蛋白質(zhì)發(fā)生各種不同的改變。

目前我國(guó)蛋類(lèi)制品主要有松花蛋、咸蛋、香鹵蛋、茶葉蛋、熏蛋、鹵雞蛋等傳統(tǒng)加工蛋制品[2]。其中松花蛋和咸蛋在我國(guó)的加工歷史已有600余年。20世紀(jì)90年代末期開(kāi)始，蛋類(lèi)產(chǎn)品的二次加工有了一定程度的發(fā)展。如1998年胡久莉等[3]研究了烤蛋的制作方法。同年，周大偉[4]對(duì)五香熏蛋的制作方法進(jìn)行了介紹。2000年馬儷珍等[5]對(duì)咸金蛋(咸雞蛋)的加工工藝進(jìn)行了研究，2001年彭艷等[6]研制出速凍食品-甜蛋，吳紅梅等[7]對(duì)五香熏蛋的制作方法進(jìn)行了改進(jìn)，岳國(guó)璋等[8]對(duì)無(wú)鉛雞蛋皮蛋的加工技術(shù)進(jìn)行了研究。而到了近幾年，魏明英等[9]研制出茶葉雞蛋干，2017年王秀娟[10]對(duì)醬鹵雞蛋工藝進(jìn)行了研究。這些研究將重點(diǎn)放在雞蛋制品的加工工藝和產(chǎn)品的色、香、味等產(chǎn)品外觀和口感質(zhì)量方面，但并未關(guān)注這些蛋類(lèi)制品在加工前后的蛋白質(zhì)組成變化。到目前為止，對(duì)雞蛋蛋白質(zhì)組成方面的研究主要集中在加工對(duì)雞蛋中致敏性物質(zhì)的免疫反應(yīng)性和加工過(guò)程中蛋白質(zhì)凝膠特性的變化[11,12]，或是以蛋白組學(xué)方法分析雞蛋中各組分的蛋白質(zhì)組成等方面的研究[13～16]。

本研究采用SDS-PAGE電泳法比較分析煮雞蛋、茶葉蛋、熟咸雞蛋、鹽焗雞蛋、鹵雞蛋及生鮮雞蛋的蛋白質(zhì)組成，從而觀察雞蛋蛋白質(zhì)組成在采用不同加工方法進(jìn)行加工后所發(fā)生的變化，以期為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)雞蛋全蛋制品是否存在摻假及是否以次充好提供科學(xué)數(shù)據(jù)，也為人們選擇更容易消化吸收的雞蛋制品提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)樣品為從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的生鮮雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋。樣品在實(shí)驗(yàn)前去殼后加入適量超純水用勻漿機(jī)將全蛋攪拌均勻制成全蛋混合物。將100μL全蛋混合物樣品分別與等體積的裂解緩沖液(0.3%SDS、3%DTT、蛋白酶抑制劑和0.5mol/LTris/HCl，pH8.0)充分混合后在低溫條件下對(duì)樣品進(jìn)行超聲波粉碎處理。在室溫條件下反應(yīng)1h后，在4℃、12000r/min條件下離心20min去除沉淀物。取上清液，以1mg/mL牛血清白蛋白溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度后分裝成每管120μg樣品并保存于-70℃冰箱中。

1.2 SDS-PAGE分析

本研究中SDS-PAGE分別采用8%和12%的分離膠[1.5mol/L Tris(pH8.8)、40%Acry/Bis(29∶1)、蒸餾水、10% SDS、10% APS、TEMED]，并采用同等蛋白質(zhì)含量的上樣方法，上樣順序?yàn)镸arker、120μg生鮮雞蛋、120μg煮雞蛋、120μg茶葉蛋、120μg咸雞蛋、120μg鹽焗雞蛋和120μg鹵雞蛋,在100V電壓條件下進(jìn)行分離。

電泳結(jié)束后取出凝膠，經(jīng)超純水漂洗后將凝膠放入固定液[30%(體積比)甲醇、10%(體積比)醋酸]中固定，1h后取出凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色24h。染色結(jié)束后用脫色液(1%醋酸)脫色后進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果與分析

將相同蛋白質(zhì)質(zhì)量的生鮮雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白在相同電泳條件下分別用8%、12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，所得的電泳圖譜分別見(jiàn)圖1和圖2。

M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1:生鮮雞蛋；2：煮雞蛋；3:茶葉蛋；4:咸雞蛋；5:鹽焗雞蛋；6:鹵雞蛋 圖1 用8%分離膠分離所得生鮮雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白電泳圖譜

M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1:生鮮雞蛋；2：煮雞蛋；3:茶葉蛋；4:咸雞蛋；5:鹽焗雞蛋；6:鹵雞蛋 圖2 12%分離膠生雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白電泳圖譜

由圖1可以看出，在8%的分離膠中生鮮雞蛋分別在200、100、60、40ku和20ku附近存在明顯的條帶，而煮雞蛋和茶葉蛋分別在120ku和85ku附近存在模糊的條帶，在70ku和60ku以下存在1條條帶，在40ku附近存在1條模糊的蛋白質(zhì)條帶。咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋雖然同樣在70ku以下存在1條蛋白質(zhì)條帶，而60ku附近只顯示模糊的條帶，在60ku以下不存在任何蛋白質(zhì)條帶。

由圖2可以看出，在12%的分離膠中生鮮雞蛋分別在200、100、60、50ku和30ku附近存在明顯的條帶，煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋在85ku附近存在1條模糊的條帶，煮雞蛋在70、60ku以下和40ku附近各存在1條條帶。而茶葉蛋中這幾條條帶相對(duì)于煮雞蛋顏色淡了很多，在40ku附近只能觀察到1條模糊的蛋白質(zhì)條帶。只有煮雞蛋和茶葉蛋在30ku附近存在模糊的蛋白質(zhì)條帶，而咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋在30ku附近不存在任何蛋白質(zhì)條帶。咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋雖然同樣在70ku以下存在1條蛋白質(zhì)條帶，但是這些條帶都相較于煮雞蛋而言淡了很多，而在60ku附近只顯示模糊的條帶，在60～20ku之間不存在任何蛋白質(zhì)條帶。在12%的分離膠中，煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋在20ku以下存在1條非常明顯的蛋白質(zhì)條帶，而在生鮮雞蛋中觀察不到這一條帶，并且所有樣品在8%分離膠中都觀察不到這一條帶，形成了鮮明的對(duì)比?？傮w來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)加工后，雞蛋中20ku以上的蛋白質(zhì)條帶基本全部變淡，只在12%分離膠的20ku以下才存在1條非常明顯的蛋白質(zhì)條帶。

3 討論與結(jié)論

為了探討加工后雞蛋的蛋白質(zhì)組成變化，本研究采用SDS-PAGE法比較分析了生鮮雞蛋、煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白主要蛋白質(zhì)組成。結(jié)果表明，加工后的雞蛋制品的蛋白質(zhì)組成與未加工的生鮮雞蛋蛋白質(zhì)組成之間表現(xiàn)出了顯著差異。在8%分離膠凝膠電泳圖譜中能觀察到生鮮雞蛋有19條蛋白質(zhì)條帶，而加工后的各種雞蛋制品中的蛋白質(zhì)條帶數(shù)量顯著減少。如煮雞蛋和茶葉蛋只有4條蛋白質(zhì)條帶，而咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋只有3條蛋白質(zhì)條帶。同樣，在12%分離膠凝膠電泳圖譜中能觀察到生鮮雞蛋有16條蛋白質(zhì)條帶，而加工后的煮雞蛋和茶葉蛋只有6條蛋白質(zhì)條帶，咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋只有4條蛋白質(zhì)條帶，并且大部分蛋白質(zhì)都集中在20 ku以下的小分子量部分。12%分離膠由于較小的孔徑，其分離蛋白質(zhì)的速度較慢，在相同的電壓和分離時(shí)間下小分子量蛋白質(zhì)相對(duì)于8%的分離膠移動(dòng)速度較慢。所以在相同的電泳條件下，在12%分離膠中能觀察到小分子量蛋白質(zhì)條帶，而在8%分離膠中觀察不到這些小分子量蛋白質(zhì)條帶。

本研究結(jié)果可為雞蛋的真?zhèn)舞b別提供參考。已報(bào)道的有關(guān)真假雞蛋鑒別的相關(guān)研究中，楊國(guó)武等[17]用雙向電泳方法分析了18個(gè)市售雞蛋的蛋白圖譜，并獲得了與真雞蛋的蛋黃蛋白質(zhì)共有的17個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，但并未對(duì)這些蛋白點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。有關(guān)加工條件對(duì)雞蛋蛋白質(zhì)組成影響的研究中，楊元元[11]對(duì)不同加工條件對(duì)卵白蛋白免疫反應(yīng)性的影響研究中，發(fā)現(xiàn)濕熱60℃、濕熱100℃、干熱100℃、干熱150℃、高溫滅菌處理卵白蛋白樣品溶液對(duì)卵白蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)并無(wú)影響。吳序櫟等[18]在進(jìn)行雞蛋過(guò)敏原分離、鑒定與純化的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋清與蛋黃蛋白粗提液按照每孔10μL上樣后蛋黃粗提液的主要蛋白質(zhì)條帶有6條；蛋清粗提液的主要蛋白質(zhì)條帶有5條。而在本研究中，生鮮雞蛋中能觀察到將近20條蛋白質(zhì)條帶。這可能與電泳時(shí)全蛋蛋白先用蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)后再定量而且每個(gè)樣品上樣量均為120μg有關(guān)。而吳序櫟等[18]用蛋清與磷酸鹽緩沖液以1∶10的體積比混合后取10μL上樣，根據(jù)參考文獻(xiàn)推測(cè)其樣品上樣量大致為100μg。因此，不同蛋白質(zhì)提取方式和不同上樣量可能是造成最終觀察到的蛋白質(zhì)條帶數(shù)量不同的原因。

到目前為止，有關(guān)煮雞蛋、茶葉蛋、咸雞蛋、鹽焗雞蛋和鹵雞蛋全蛋蛋白與生鮮雞蛋全蛋蛋白比較的研究鮮有報(bào)道。本研究采用SDS-PAGE法比較分析了生鮮雞蛋和這些雞蛋加工產(chǎn)品的全蛋蛋白質(zhì)，揭示了雞蛋加工前后蛋白質(zhì)組成的變化以及不同加工方法對(duì)雞蛋蛋白質(zhì)組成變化的影響。本研究所獲得的結(jié)果對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)雞蛋全蛋制品是否摻假及是否以次充好提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，也為消費(fèi)者選擇更容易消化吸收的雞蛋制品提供了參考。本研究采用的是比較簡(jiǎn)便的SDS-PAGE法，所以只能觀察到不同加工方法導(dǎo)致的蛋白質(zhì)組分差異，要了解有表達(dá)差異的蛋白質(zhì)條帶的具體信息還需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定。