易承學(xué)，曹 杰，徐 虹，徐希明，余江南

0 引言

丹皮酚(Paeonol)又稱牡丹酚，是從毛茛科芍藥屬植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.、芍藥P.lactifloraPall.的根皮和蘿摩科植物徐長卿Cynanchumpaniculatum(Bunge) Kitag.的干燥根或全草中提取出的有效成分[1]，化學(xué)名為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，結(jié)構(gòu)式見圖1。研究表明，丹皮酚在抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化及抗過敏等方面均呈現(xiàn)出良好的藥理活性[2-3]，開發(fā)前景廣闊，臨床上有丹皮酚軟膏，丹皮酚(磺酸鈉)注射劑和丹皮酚片等制劑，多用于心腦血管、腫瘤、炎癥、變態(tài)反應(yīng)及免疫系統(tǒng)等疾病[4]。但該藥存在易揮發(fā)、水溶性差、體內(nèi)半衰期短及生物利用度低等不足，近年來圍繞其新劑型的研究日趨活躍[5-8]。

有關(guān)丹皮酚的測定方法中較常見的有紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜法和氣相色譜法[9]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)既具備氣相色譜的高效在線分離能力，又發(fā)揮了質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度檢測能力，專屬性強，檢測限低，是組分復(fù)雜及微量樣品分離分析最有力的研究手段，在藥物分析領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用[10-11]。藥物的溶解度是影響藥物在生物體內(nèi)吸收程度和速度的重要因素之一，亦是制劑研究的重要參數(shù)，測定藥物在不同介質(zhì)中的溶解度有助于指導(dǎo)其劑型的合理設(shè)計。本實驗采用GC-MS，以聯(lián)苯為內(nèi)標(biāo)，建立了丹皮酚的含量分析方法，并研究該藥在15種常用有機溶劑中的平衡溶解度，旨在為進一步設(shè)計和開發(fā)出丹皮酚新劑型提供有益參考。

圖1 丹皮酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，XPE205電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，ROTINA 380R離心機(德國Hettich公司)，THZ-300型恒溫?fù)u床(上海一恒科技有限公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 對照品丹皮酚(純度99.2%，批號：C1610281)、內(nèi)標(biāo)正十五烷(純度99.8%，批號：F1508060)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，內(nèi)標(biāo)聯(lián)苯(純度99.99%，批號：G124924)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。丹皮酚原料自制。大豆油和精制玉米油由江西益普生藥業(yè)有限公司提供，中鏈甘油三酸酯由鐵嶺北亞藥用油有限公司提供，正丁酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、異丙醇、乙醇、乙二醇、聚乙二醇200和聚乙二醇400均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供，聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氫化蓖麻油由德國BASF公司提供。石油醚(35～60 ℃)由美國Tedia公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹皮酚GC-MS測定方法

2.1.1 分析條件 色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度220 ℃，載氣為高純氦氣，流速1 ml/min，柱溫采用程序升溫，初始溫度50 ℃，以20 ℃/min升至220 ℃，分流比為10∶1，進樣體積為1.0 μl。

質(zhì)譜條件：氣質(zhì)接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，電子轟擊源(EI)電離方式，電子能量為70 eV，溶劑延遲5 min。選擇離子檢測模式(SIM)，丹皮酚的選擇離子166、151、108，定量分析離子151。聯(lián)苯的選擇離子154、153、152、76，定量分析離子154。

2.1.2 溶液的配制 內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取聯(lián)苯適量，石油醚溶解，配成2.02 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。對照品溶液：精密稱取丹皮酚適量，用石油醚溶解后定容，制成5.02 mg/ml溶液，作為對照品儲備液。精密吸取該儲備液0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 ml于5 ml容量瓶中，各精密加入0.25 ml內(nèi)標(biāo)液，石油醚稀釋至刻度，制成系列質(zhì)量濃度對照品溶液。供試品溶液：稱取丹皮酚原料50 mg，置10 ml容量瓶中，加石油醚溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該溶液0.1 ml，置5 ml容量瓶中，精密加入0.25 ml內(nèi)標(biāo)溶液，石油醚定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察 系統(tǒng)適用性考察：取對照品溶液與供試品溶液1 μl注入氣質(zhì)聯(lián)用儀，按照“2.1.1”項條件進行分析，丹皮酚和聯(lián)苯分離良好，樣品測定無干擾。丹皮酚和聯(lián)苯的保留時間分別為7.411 min和7.035 min，質(zhì)譜圖見圖2。從圖2可以看出，m/z166、151、108和m/z154、153、152、76分別為二者的主要碎片離子峰，相對豐度高，且無干擾。

圖2 丹皮酚(A)、聯(lián)苯(B)的GC-MS質(zhì)譜圖

線性關(guān)系考察：取上述系列質(zhì)量濃度對照品溶液各1 μl進樣分析，每種濃度的待測液連續(xù)進樣2次。以對照品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度之比(x)為橫坐標(biāo)，二者峰面積之比的2次平均值(y)為縱坐標(biāo)，進行線性回歸分析，得回歸方程為：y=0.786 5x-0.072，r=0.999 5，表明丹皮酚在25.1～401.6 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗:取同一對照品溶液，按照“2.1.1”項分析條件連續(xù)進樣6次，計算峰面積的RSD，考察方法的精密度。結(jié)果丹皮酚與聯(lián)苯峰面積比值的RSD為1.6%，表明本方法精密度好。

穩(wěn)定性試驗:將供試品溶液置棕色瓶中于25 ℃下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h時取樣1 μl測定，計算丹皮酚含量，考察樣品的穩(wěn)定性，RSD為2.4%，表明24 h內(nèi)供試品的石油醚溶液基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批丹皮酚原料適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，照“2.1.1”項分析條件進樣測定，內(nèi)標(biāo)法計算其含量。結(jié)果樣品中丹皮酚平均含量為86.7%，RSD為1.8%，說明該方法重復(fù)性好。

加標(biāo)回收試驗:取已測知含量的同一批丹皮酚原料適量，按“2.1.2”項下供試品溶液濃度的80%、100%、120%分別配制低、中、高3種濃度的溶液各3份，作為供試溶液。照“2.1.1”項下分析條件測定并計算回收率。低、中、高3種質(zhì)量濃度的平均回收率分別為97.0%、99.7%、102.3%(n=3)，RSD分別為2.3%、1.9%、2.5%(n=3)，表明該方法的準(zhǔn)確度較高，符合含量測定的要求。

2.1.4 樣品含量測定 取3批丹皮酚原料，精密稱量后按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定含量。結(jié)果3批樣品的含量分別為86.7%、87.2%和87.9%。

2.2 丹皮酚平衡溶解度測定

2.2.1 溶解平衡時間考察 稱取丹皮酚約3 g至100 ml具塞三角瓶中，加入10 g大豆油后密封，置恒溫?fù)u床中，25 ℃下100 r/min振搖，于1、2、4、6、8、12 h時間點取1 g溶液后，補足溶劑，在恒溫條件下經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，精密移取50 mg續(xù)濾液至10 ml容量瓶中，添加0.5 ml內(nèi)標(biāo)溶液，然后用石油醚定容，GC-MS法測定，并以振搖時間(h)對丹皮酚濃度(mg/g)作圖，得丹皮酚在大豆油中的溶解平衡曲線(見圖3)。既往研究表明，丹皮酚在蒸餾水中振搖72 h方能達到溶解平衡[12]，本實驗發(fā)現(xiàn)其在大豆油中振搖4 h即可實現(xiàn)。這是由于丹皮酚是一種疏水性的小分子酚類化合物，易溶于有機溶劑，因而明顯縮短了溶解平衡時間。

圖3 丹皮酚在大豆油中振搖溶解平衡曲線

2.2.2 平衡溶解度測定 試驗中選擇15種溶劑：乙醇、異丙醇、乙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、大豆油、精制玉米油、肉豆蔻酸異丙酯、中鏈甘油三酸酯、正丁酸乙酯、油酸乙酯。取過量丹皮酚置10 ml具塞試管中，分別加入5 g上述溶劑，超聲30 min，于25 ℃下100 r/min振搖24 h，取出離心(6 000 r/min,10 min)，吸取各上清飽和溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，精密稱取適量續(xù)濾液至10 ml容量瓶中，石油醚稀釋至線性范圍內(nèi)，加入0.5 ml內(nèi)標(biāo)溶液，定容后搖勻，取1 μl注入氣質(zhì)聯(lián)用儀進行測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算丹皮酚在各溶劑中的平衡溶解度。據(jù)參考文獻，丹皮酚在水中的溶解度僅為0.386 mg/ml，屬于“幾乎不溶或不溶”范疇[12]，但本實驗結(jié)果顯示其在有機溶劑中的溶解度顯著增大，其中在正丁酸乙酯中最大，為376.8 mg/g，在乙二醇中最小，為21.5 mg/g。見表1。

3 討論

GC-MS含量測定采用內(nèi)標(biāo)法較為準(zhǔn)確，而選擇合適的內(nèi)標(biāo)物很重要。本實驗對2種內(nèi)標(biāo)物聯(lián)苯和正十五烷在所選色譜柱上的保留時間和響應(yīng)值進行了考察，結(jié)果顯示,二者的保留時間分別為7.035 min和7.689 min，出峰時間均適中，但聯(lián)苯的響應(yīng)值要高于正十五烷，且價廉易得，故以其作為內(nèi)標(biāo)物。

表1 丹皮酚在25 ℃不同溶劑中的平衡溶解度(n=3)

徐本亮等[13]采用高效液相色譜法測定了丹皮酚在水、磷酸鹽緩沖液及甲醇等常用有機溶劑中的平衡溶解度，本次實驗就丹皮酚在表面活性劑、助表面活性劑、油相中的平衡溶解度進行了測定。鑒于丹皮酚的水溶性差，提示其普通固體制劑將在胃腸道表現(xiàn)出溶出速率緩慢，導(dǎo)致吸收差，生物利用度低下。因此，在設(shè)計新劑型時，可考慮通過制備脂質(zhì)體、納米乳、納米囊和納米球等納米制劑，以及固體分散技術(shù)、包合技術(shù)等制劑新技術(shù)來提高其溶解度，進而改善生物利用度。本實驗結(jié)果顯示，丹皮酚在文中所列出的幾種表面活性劑、助表面活性劑和油相中的平衡溶解度均較大，其中在正丁酸乙酯中最大，油酸乙酯次之，這可以為制劑配伍輔料的選擇提供依據(jù)。