何雨峰 段金秋 黃 雪 董恒利 李寧俠*

肺炎是終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，可由細(xì)菌、真菌、寄生蟲等致病微生物引起，細(xì)菌性肺炎占各類肺炎的80%，以肺炎球菌感染多見(jiàn)[1]。肺炎鏈球菌的檢測(cè)可通過(guò)痰和(或)血培養(yǎng)、Gram染色、尿抗原檢測(cè)或定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction)，PCR)等方式，痰和(或)血培養(yǎng)生物體分離困難，陽(yáng)性率較低，檢查前抗生素的應(yīng)用也會(huì)降低敏感性。尿抗原檢測(cè)在不同研究中的結(jié)論尚不一致，定量熒光PCR反應(yīng)可通過(guò)對(duì)非培養(yǎng)樣本進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定量分析，檢測(cè)肺炎球菌的DNA負(fù)荷(LytA基因)，有助于對(duì)疾病嚴(yán)重程度和病死風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估[2-3]。降鈣素原(procalcitonin，PCT)是感染的特異性標(biāo)志物，常用于細(xì)菌感染的輔助診斷和病情評(píng)估[4]。尿激酶型纖溶酶激活物受體(urine kinase plasminogen activator receptor，uPAR)是單鏈膜糖蛋白，物理?xiàng)l件下表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、激活的T細(xì)胞等表面，在腫瘤和炎癥等病理?xiàng)l件下，uPAR脫落成為可溶性u(píng)PAR(soluble urokinase plasminogen activator receptor，suPAR)，監(jiān)測(cè)suPAR水平研究疾病病程已經(jīng)成為重要研究方向[5]。本研究探討采用PCR法檢測(cè)血液肺炎球菌DNA負(fù)荷(LytA)量、PCT和suPAR水平，觀察三者與肺炎球菌感染患者病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月至2018年2月在西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的184例肺炎鏈球菌感染患者，其中男性103例，女性81例；年齡23～68歲，平均年齡(52.37±11.45)歲。按照肺炎嚴(yán)重度指數(shù)(pneumonia severity index，PSI)進(jìn)行分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)30例，Ⅱ級(jí)41例，Ⅲ級(jí)68例，Ⅳ級(jí)30例，Ⅴ級(jí)15例。依據(jù)病情嚴(yán)重程度將患者分為輕度組(71例)，中度組(68例)和重度組(45例)。所有患者在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等一般資料相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①痰培養(yǎng)肺炎鏈球菌感染；②年齡≥18歲，性別不限；③急性起病，之前未進(jìn)行過(guò)藥物治療；④對(duì)研究知情并簽署知情同意書。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①細(xì)菌、支原體及病毒混合感染者；②合并其他部位炎癥、肺結(jié)核、惡性腫瘤及其他重大疾病者；③合并精神、智力及思維異常者；④擬納入或已納入其他臨床研究者。

1.3 儀器與試劑

采用TaqMan7500系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國(guó)ABI公司)；SDS 7500 Fast System Software v1.5.1.熒光定量PCR分析軟件(美國(guó)ABI公司)；suPAR試劑盒購(gòu)于美國(guó)ADL公司；PCT分析儀及試劑盒均購(gòu)自德國(guó)BRAHMS公司；QuaAMP DNA Mini Kit核酸提取套盒(荷蘭Qiagen公司)。

1.4 研究方法

患者入組后，收集2 ml靜脈血加入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，室溫保持24 h，用于DNA分離，參照Peter等[7]改良的方法進(jìn)行肺炎球菌DNA分離，1 ml血樣采用QuaAMP DNA Mini Kit核酸提取套盒根據(jù)使用指導(dǎo)進(jìn)行DNA提取，采用50 μl洗脫緩沖液洗脫提取的DNA，采用TaqMan7500系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)擴(kuò)增DNA，采用LytA基因引物進(jìn)行肺炎鏈球菌特異性檢測(cè)，已知肺炎球菌負(fù)荷量的標(biāo)本用于量化，LytA基因引物序列:LytA FW 5＇-ACGCAATCTAGCAGATGAAGC-3＇LytA RV 5＇-TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC-3＇，LytA probe5＇-FAMTTTGCCGAAAACGCTTG ATACAGGG-BHQ1-3＇，實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)條件:95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，45循環(huán)，45 ℃，1 min，45循環(huán)，采用SDS 7500 Fast System Software v1.5.1熒光定量PCR分析軟件分析，如測(cè)序成功則認(rèn)為結(jié)果陽(yáng)性。采用半定量免疫色譜法檢測(cè)PCT水平。

1.5 觀察與判定指標(biāo)

采用PSI評(píng)分[6]進(jìn)行病情評(píng)價(jià)，PSI包括年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、生命體征異常、實(shí)驗(yàn)室檢查異常、胸腔積液等維度組成，PSIⅠ級(jí)為≤50分，Ⅱ級(jí)為51～70分，Ⅲ級(jí)為71～90分，Ⅳ級(jí)為91～130分，Ⅴ級(jí)為＞130分，Ⅰ～Ⅱ級(jí)提示為輕度肺炎，Ⅲ級(jí)提示為中度肺炎，Ⅳ級(jí)和Ⅴ級(jí)提示為重度肺炎。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法，相關(guān)性分析采用Spearman法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病情分級(jí)患者LytA、PCT和suPAR水平相比較

3組患者LytA陽(yáng)性率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.900，P＞0.05)；LytA、PCT和suPAR水平隨著病情分度增加逐漸升高，3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.057，F(xiàn)=73.892，F(xiàn)=48.509；P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 LytA、PCT及suPAR水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，LytA、PCT及suPAR水平與肺炎球菌感染患者病情嚴(yán)重程度均呈顯著正相關(guān)(r=0.472，r=0.506，r=0.438；P＜0.05)；LytA量與PCT、suPAR水平呈顯著正相關(guān)(r=0.603；r=0.682；P＜0.05)。

3 討論

肺炎是導(dǎo)致患者住院和死亡的重要原因，目前雖然多種方法可用于病原菌的分離和鑒定，但患者疾病嚴(yán)重程度分類存在一定困難。肺炎從輕癥至重癥差別較大，初始抗菌藥物選擇、實(shí)驗(yàn)室檢查強(qiáng)度、是否需要住院或住ICU等措施均與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，而正確的病情分度可指導(dǎo)臨床醫(yī)師的診療工作[8-9]。PSI是最常用的臨床評(píng)分系統(tǒng)，其初衷是為了準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肺炎患者的病死率，但PSI評(píng)分是由包括年齡、基礎(chǔ)疾病、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查等4個(gè)維度的20個(gè)變量組成，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和分?jǐn)?shù)計(jì)算過(guò)于復(fù)雜和繁瑣，不利于臨床醫(yī)師臨床實(shí)際運(yùn)用，且年齡在PSI中所占比重較大，易對(duì)年輕患者的病情嚴(yán)重程度評(píng)估不足[10]。因此，探討可客觀反映肺炎病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)成為臨床研究的熱點(diǎn)。

表1 三組患者LytA、PCT和suPAR水平相比較(s)

表1 三組患者LytA、PCT和suPAR水平相比較(s)

注：表中LytA為肺炎球菌DNA負(fù)荷；PCT為降鈣素原；suPAR為可溶性尿激酶型纖溶酶激活物受體；

檢測(cè)指標(biāo)水平LytA×102genomes/ml PCT(ng/ml) suPAR(ng/ml)輕度組 71 61(85.92) 2.35±2.05 4.38±2.97 2.08±1.25中度組 68 62(91.18) 4.69±3.18 6.92±3.14 3.85±1.46重度組 45 42(93.33) 7.45±4.47 9.40±3.82 4.99±2.05 F值 1.900 62.057 73.892 48.509 P值 0.387 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 例數(shù) LytA陽(yáng)性率[例(%)

患者的血培養(yǎng)至少需要24～48 h，而PCR可在4 h內(nèi)得出檢查結(jié)果，與血培養(yǎng)相比較具有明顯優(yōu)勢(shì)。Said等[2]研究顯示，成人肺炎患者血液中肺炎球菌LytA陽(yáng)性率為25%；Loonen等[11]研究顯示，成人肺炎中LytA陽(yáng)性率為20%；Peters等[12]研究顯示，血培養(yǎng)結(jié)果在肺炎鏈球菌的成年患者中，PCR檢測(cè)LytA的陽(yáng)性率為82%。

本研究結(jié)果顯示，輕度、中度及重度患者PCR檢測(cè)LytA陽(yáng)性率分別為85.92%、91.18%和93.33%，高于有關(guān)報(bào)道[2，11]；且與以下因素有關(guān):①LytA受血液中細(xì)菌負(fù)荷影響，細(xì)菌負(fù)荷過(guò)低，則不易通過(guò)血液和PCR獲得，與Said等[2]和Loonen等[11]研究相比較，本研究納入病例為血培養(yǎng)陽(yáng)性患者，Rello等[13]研究亦顯示，血培養(yǎng)陽(yáng)性患者PCR檢測(cè)陽(yáng)性率高；②LytA受抗生素影響有關(guān)，如在抽取血液標(biāo)本前給予抗生素則可能降低LytA基因表達(dá)，本研究納入病例將給予抗生素患者排除。

本研究結(jié)果顯示，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，LytA逐漸增加，相關(guān)性研究顯示，肺炎球菌DNA負(fù)荷與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，結(jié)果提示，肺炎球菌DNA負(fù)荷增加預(yù)示細(xì)菌負(fù)荷增加，是導(dǎo)致疾病加重的關(guān)鍵因素[14]。

PCT是臨床常用的炎性標(biāo)志物，通常血清PCT濃度＞0.5 ng/ml即認(rèn)為有細(xì)菌感染，其水平在細(xì)菌性肺炎的診斷和預(yù)后判定中具有重要臨床價(jià)值，已經(jīng)得到多個(gè)臨床研究證實(shí)[15-16]。本研究結(jié)果顯示，所有組別肺炎球菌感染患者血清PCT水平均高于0.5 ng/ml，且隨著病情嚴(yán)重程度增加，其水平呈增加趨勢(shì)，與李艷麗[15]和蔡錦洪[16]研究一致。近年來(lái)的研究顯示，suPAR可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、促進(jìn)白細(xì)胞遷移、參與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等機(jī)制參與細(xì)菌感染性炎癥的發(fā)生和發(fā)展，可預(yù)測(cè)患者細(xì)菌感染的嚴(yán)重程度、預(yù)后和病死風(fēng)險(xiǎn)，被認(rèn)為在全身炎癥反應(yīng)性綜合征的診斷和嚴(yán)重度評(píng)估中具有重要價(jià)值[17]。Sawa等[18]研究顯示，suPAR是肺炎預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，與傳統(tǒng)的炎性標(biāo)志物和X射線相比較，提示肺炎的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后具有更高的臨床價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，suPAR水平與患者病情嚴(yán)重分度呈正相關(guān)，結(jié)果與Sawa等[18]的研究一致。本研究結(jié)果顯示，LytA基因與PCT和suPAR均有良好的相關(guān)性，且LytA基因?qū)︻A(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度具有良好價(jià)值。

肺炎球菌肺炎患者血液LytA基因與患者的疾病嚴(yán)重程度及傳統(tǒng)指標(biāo)PCT和新型指標(biāo)suPAR均有良好的相關(guān)性，但本研究?jī)H探討了血培養(yǎng)陽(yáng)性患者LytA基因與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，對(duì)血培養(yǎng)陰性患者的臨床價(jià)值尚需要進(jìn)一步研究探討。