王婷婷，鄭昕蕊，李文燕，張紅霞，李鋒杰，于麗

（濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山東省神經(jīng)疾病與再生修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濰坊261053）

近幾年，隨著霧霾現(xiàn)象加重，人們?cè)絹?lái)越擔(dān)心空氣污染對(duì)健康造成的負(fù)面影響。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局于2015年發(fā)布的《氮氧化物的綜合科學(xué)評(píng)估 - 健康標(biāo)準(zhǔn)》（第二次外部評(píng)估草案）顯示空氣污染物主要包括氮氧化物、二氧化硫、臭氧、PM2.5（ fine particulate matter with diameter of ≤ 2.5μm）和 PM10（fine particulate matter with diameter of ≤ 10μm），其中PM2.5成分復(fù)雜，引起的危害尤為關(guān)注。研究表明，母源性PM2.5暴露可引起孕婦的慢性炎癥進(jìn)而影響胎兒的發(fā)育[1]。因PM2.5顆粒物極小，直徑小于2.5μm，可以吸入肺通過(guò)氣血屏障、胎盤(pán)屏障及血腦屏障，妊娠期暴露于空氣污染可對(duì)胎兒及兒童的神經(jīng)發(fā)育造成潛在危害[2-4]。Umezawa等[5]發(fā)現(xiàn)超微大氣顆粒物可能直接造成胎兒大腦的神經(jīng)炎癥，但其確切機(jī)制尚不清楚。

課題組前期已觀察到妊娠期PM2.5暴露可導(dǎo)致子代鼠出現(xiàn)腦損傷[6]。本實(shí)驗(yàn)采用改良快速氣管滴注法建立妊娠小鼠PM2.5染毒模型，研究子代鼠出生后生長(zhǎng)發(fā)育期大腦皮層TNF-α、IL-1β和IFN-γ等炎癥因子的表達(dá)變化，并檢測(cè)PM2.5對(duì)子代鼠大腦皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的影響，從而探討母源性PM2.5暴露導(dǎo)致子代發(fā)育期大腦皮層出現(xiàn)持續(xù)神經(jīng)炎癥發(fā)生的機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠，7～8周齡，小鼠體重34±4g，購(gòu)自山東青島市動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)條件：室溫22℃左右，自由飲水、進(jìn)食。

2 PM2.5 標(biāo)本的采樣和處理

使用大氣顆粒物采樣器，收集 2015 年 12 月至2016 年 1 月采暖季某地級(jí)市城區(qū)大氣PM2.5。制備樣品的方法參考課題組前期的研究[6]。

3 動(dòng)物分組和造模

受試小鼠按雌雄2∶1合籠，次日查出陰栓者記為妊娠第1天。將孕鼠隨機(jī)分為空白組、PBS對(duì)照組、PM2.5模型組（分為低、中、高劑量組），每組 6只。空白組不做任何處理，對(duì)照組氣管內(nèi)滴注PBS 30μl，PM2.5低、中、高劑量組參照課題前期方法[7]分別注入濃度為 0.2592μg/μl、1.56695μg/μl和3.456μg/μl的 PM2.5混懸液 30μl，從妊娠第 1 天開(kāi)始每3天采用快速小鼠氣管滴注改良法滴注 1 次，整個(gè)孕期共 7 次。

4 ELISA檢測(cè)炎癥因子的變化

子代鼠分別在出生后第1d、7d、14d、21d、30d處死，分離大腦皮層。組織勻漿提取總蛋白，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明，采用ELISA試劑盒檢測(cè)妊娠期PM2.5子代鼠大腦皮層TNF-α、IL-1β和IFN-γ的含量。首先配制標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度求出相應(yīng) OD值，并計(jì)算出直線回歸方程畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)各樣品的 OD 值計(jì)算出相應(yīng)TNF-α、IL-1β和IFN-γ的濃度。

5 免疫熒光/TUNEL雙標(biāo)染色檢測(cè)

子代鼠出生后第14d，5%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛全身灌注，完整剖取鼠腦；將鼠腦依次放入4℃，30%、25%、20%蔗糖梯度脫水；冰凍切片，切片厚度20μm，-20℃保存；37℃烤箱烤片30min，PBS洗5min×3次，微波抗原修復(fù)冷卻至室溫，PBS清洗后滴加10%羊血清37℃烤箱50min，甩去羊血清，滴加小鼠抗NeuN單克隆抗體（1∶300）或小鼠抗GFAP單克隆抗體（1∶200）或兔抗Iba1多克隆抗體（1∶50），陰性對(duì)照滴加等體積的PBS，37℃烤箱孵育1h，室溫1h，4℃過(guò)夜；37℃ 1h，PBS清洗，根據(jù)一抗種屬滴加Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶200)或Alexa Fluor-594標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶200）的二抗，37℃避光孵育1h；PBS清洗后，采用原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒檢，配制反應(yīng)液（50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液）滴加到組織上，陰性對(duì)照組僅滴加20μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液，37℃避光孵育1h，滴加Hoechst33258（1∶1000）37℃避光孵育25min，PBS清洗，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。隨機(jī)從每個(gè)樣品的皮層組織選取5張高倍數(shù)圖像，用Image-Pro Plus軟件對(duì)每張圖片的熒光強(qiáng)度和腦細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 PM2.5暴露導(dǎo)致子代鼠發(fā)育期大腦皮層炎癥因子升高

ELISA測(cè)定顯示，與對(duì)照組相比，PM2.5暴露后子代鼠出生后生長(zhǎng)發(fā)育期大腦皮層中TNF-α、IL-1β和IFN-γ表達(dá)均呈增多趨勢(shì)。出生第7d，與對(duì)照組相比，PM2.5模型組子代鼠大腦皮層IL-1β增加不明顯，TNF-α和IFN-γ的表達(dá)逐漸增多，并與PM2.5劑量呈正比，且PM2.5高劑量組差異明顯（圖1A-C）。出生第14d，與對(duì)照組相比，PM2.5模型組子代鼠大腦皮層TNF-α、IL-1β和IFN-γ的表達(dá)均增多，PM2.5中劑量組IFN-γ表達(dá)差異明顯，PM2.5高劑量組TNF-α和IL-1β的表達(dá)差異顯著（圖1A-C）。出生第21d，與對(duì)照組相比，PM2.5模型組子代鼠大腦皮層TNF-α、IL-1β和IFN-γ的表達(dá)均增多，PM2.5中、高劑量組TNF-α和IFN-γ表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PM2.5高劑量組IL-1β則有明顯差異（圖1A-C）。出生第1d和第30d的子代鼠大腦皮層上述炎癥因子變化不明顯。

圖1 孕期PM2.5暴露后子代鼠大腦皮層中TNF-α、IL-1β和IFN-γ水平ELISA檢測(cè)。A，TNF-α；B，IL-1β；C，IFN-γ；*，與對(duì)照組相比，0.01＜P＜0.05（n=5）Fig. 1 ELISA assay to determine the levels of TNF-α, IL-1β and IFN-γ in the frontal cortex of mouse offspring after maternal exposure to PM2.5 during pregnancy. A, TNF-α. B, IL-1β. C, IFN-γ. *0.01＜P＜0.05, compared with control (n=5)

2 PM2.5暴露對(duì)子代鼠大腦皮層神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響

出生后14d，免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，PM2.5模型組子代鼠大腦皮層額葉區(qū)NeuN陽(yáng)性細(xì)胞分布稀疏；熒光強(qiáng)度定量分析顯示，與對(duì)照組相比，PM2.5中、高劑量組NeuN免疫反應(yīng)性明顯降低（圖2A、2B）。相反，PM2.5模型組子代鼠大腦皮層額葉區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)逐漸增多，細(xì)胞胞體肥大，突起增多延長(zhǎng)，PM2.5高劑量組GFAP免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)（圖3A、3B）；PM2.5模型組子代鼠大腦皮層額葉區(qū)Iba1陽(yáng)性細(xì)胞同樣呈逐漸增多趨勢(shì)，Iba1陽(yáng)性細(xì)胞的胞體變大，突起縮短，PM2.5高劑量組Iba1免疫反應(yīng)性也明顯增強(qiáng)（圖4A、4B）。

與對(duì)照組相比，PM2.5中、高劑量組子代鼠大腦皮層額葉區(qū)可見(jiàn)NeuN/TUNEL雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，尤以PM2.5高劑量組明顯（圖2A、2B）；PM2.5高劑量組子代鼠大腦皮層額葉區(qū)GFAP/TUNEL雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多（圖3A、3B），中、高劑量組Iba1/TUNEL雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增多（圖4A、4B）。

討 論

大量的流行病學(xué)調(diào)查表明，PM2.5已成為心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。研究證實(shí)，PM2.5能夠引起全身炎癥反應(yīng)[8]。本課題前期通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著PM2.5吸入劑量的增加，孕鼠及子代鼠心、肝、脾、肺、腎等主要臟器均出現(xiàn)炎癥等病理變化[7,9]。炎癥反應(yīng)在PM2.5誘導(dǎo)的損傷中發(fā)揮重要作用?？諝馕廴疚飳?duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的潛在不利影響已引起關(guān)注，但妊娠期持續(xù)暴露于PM2.5可否引起后代發(fā)生長(zhǎng)期神經(jīng)炎癥，目前尚不清楚。

當(dāng)空氣污染物進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生先天性免疫應(yīng)答。通過(guò)評(píng)估腦細(xì)胞炎癥因子（如IL-1β、TNF-α和IFN-γ）的水平可以觀察到這種反應(yīng)，這些細(xì)胞炎癥因子是突出的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，可將促炎信號(hào)傳導(dǎo)至免疫細(xì)胞釋放新的炎癥因子[10]。為了探討妊娠期PM2.5暴露致胎兒和兒童期神經(jīng)炎癥發(fā)生的機(jī)制，本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)了妊娠期暴露于PM2.5對(duì)子代鼠大腦皮層TNF-α、IL-1β和IFN-γ等炎癥因子水平的影響，結(jié)果顯示，妊娠期暴露于PM2.5環(huán)境后，子代鼠大腦皮層TNF-α、IL-1β和IFN-γ等炎癥因子水平升高，由此進(jìn)一步證實(shí)妊娠期PM2.5暴露可致子代鼠大腦炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，出生后14d和21d的PM2.5模型組子代鼠的TNF-α、IL-1β和IFN-γ等炎癥因子持續(xù)增高。14d和21d齡的小鼠相當(dāng)于人的青春期間段，處于生長(zhǎng)發(fā)育的重要階段，母體炎癥致子代的炎癥反應(yīng)一般不會(huì)持續(xù)太久，說(shuō)明PM2.5可能直接作用于子代鼠引起神經(jīng)炎癥，從而造成子代神經(jīng)發(fā)育障礙。

圖2 孕期PM2.5暴露后子代鼠大腦皮層額葉區(qū)NeuN免疫反應(yīng)性與NeuN/TUNEL雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)變化。A，NeuN免疫熒光與NeuN/TUNEL雙標(biāo)染色， Hoechst復(fù)染細(xì)胞核；比例尺，75μm；B，大腦皮層額葉區(qū)NeuN免疫熒光強(qiáng)度（左）和NeuN/TUNEL雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)（右）統(tǒng)計(jì)學(xué)分；*，與對(duì)照組相比，0.01＜P＜0.05；**，與對(duì)照組比較，P＜0.01（n=5）Fig. 2 Changes of NeuN immunoreactivity and NeuN/TUNEL double positive cell number in the frontal cortex of mouse offspring after maternal exposure to PM2.5 during pregnancy. A, NeuN/TUNEL double staining with Hoechst counter stain of nuclei. Scale bar, 75μm; B, Quantitative analysis of NeuN fluorescence intensity (left) and number of NeuN/TUNEL double positive cells (right). *, 0.01＜P＜0.05, **, P＜0.01, compared with control (n=5)

PM2.5具有潛在的神經(jīng)毒性，其超微顆?？梢晕敕危┻^(guò)氣血屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，穿過(guò)胎盤(pán)屏障和血腦屏障，從而引起神經(jīng)炎癥。我們推測(cè)，PM2.5可以通過(guò)兩條途徑引起胎兒的神經(jīng)炎癥。間接途徑為PM2.5直接誘導(dǎo)母體的炎癥反應(yīng)釋放炎癥因子，炎癥因子通過(guò)胎盤(pán)屏障，進(jìn)而穿過(guò)胎兒的血腦屏障引起神經(jīng)炎癥；直接途徑為PM2.5進(jìn)入孕鼠體循環(huán)，直接穿過(guò)胎盤(pán)屏障，損傷胎兒的血腦屏障，導(dǎo)致子代鼠的神經(jīng)炎癥。Schaafsma等[11]發(fā)現(xiàn)，妊娠期母體炎癥，胎兒小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)增加，表明母源炎癥反應(yīng)是胎兒腦小膠質(zhì)細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的來(lái)源，進(jìn)而證明PM2.5可通過(guò)間接途徑引起胎兒的神經(jīng)炎癥。

圖3 孕期PM2.5暴露后子代鼠大腦皮層額葉區(qū)GFAP免疫反應(yīng)性與GFAP/TUNEL雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)變化。A，GFAP免疫熒光與GFAP/TUNEL雙標(biāo)染色， Hoechst復(fù)染細(xì)胞核；比例尺，75μm；B，大腦皮層額葉區(qū)GFAP免疫熒光強(qiáng)度（左）和GFAP/TUNEL雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)（右）統(tǒng)計(jì)學(xué)分；**，與對(duì)照組比較，P＜0.01（n=5）Fig. 3 Changes of GFAP immunoreactivity and GFAP/TUNEL double positive cell number in the frontal cortex of mouse offspring after maternal exposure to PM2.5 during pregnancy. A, GFAP/TUNEL double staining with Hoechst counter staining for nuclei. Scale bar, 75μm. B, Quantitative analysis of GFAP fluorescence intensity (left) and number of GFAP/TUNEL double positive cells (right). **, P＜0.01, compared with control (n=5)

圖4 孕期PM2.5暴露后子代鼠大腦皮層額葉區(qū)Iba 1免疫反應(yīng)性與Iba 1/TUNEL雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)變化。A，Iba 1免疫熒光與Iba 1/TUNEL雙標(biāo)染色， Hoechst復(fù)染細(xì)胞核；比例尺，75μm；B，大腦皮層額葉區(qū)Iba 1免疫熒光強(qiáng)度（左）和Iba 1/TUNEL雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)（右）統(tǒng)計(jì)學(xué)分；**，與對(duì)照組比較，P＜0.01（n=5）Fig. 4 Changes of Iba 1 immunoreactivity and Iba 1/TUNEL double positive cell number in the frontal cortex of mouse offspring after maternal exposure to PM2.5 during pregnancy. A, Iba 1/TUNEL double staining with Hoechst counter staining for nuclei. Sscale bar, 75μm. B, Quantitative analysis of Iba 1 fluorescence intensity (left) and number of Iba 1/TUNEL double positive cells (right). **, P＜0.01, compared with control (n=5)

許多神經(jīng)疾病的共同特征是血腦屏障完整性的破壞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫細(xì)胞[12]。為明確IL-1β、TNF-α和IFN-γ與星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞關(guān)系，本研究先通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)出生后14d、21d的子代鼠炎癥因子表達(dá)較明顯，進(jìn)一步采用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)出生14d子代鼠神經(jīng)細(xì)胞GFAP和Iba1，發(fā)現(xiàn)在大腦皮層額葉區(qū)，隨著PM2.5吸入劑量的增加，GFAP和Iba1熒光強(qiáng)度增加，說(shuō)明妊娠期暴露于PM2.5環(huán)境中子代鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。IFN-γ可誘導(dǎo)的小鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，釋放高水平的IL-1β和TNF-α等炎癥因子及細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而造成神經(jīng)元失能及細(xì)胞死亡[13,14]，并且活化的神經(jīng)炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞可誘發(fā)具有神經(jīng)毒性的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞[15]?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF和FGF等因子。FGF通過(guò)阻斷觸發(fā)VE-鈣粘蛋白內(nèi)化（ Vascular endothelial cadherin），VEGF則通過(guò)調(diào)節(jié)連接分子的表達(dá)來(lái)破壞BBB完整性，進(jìn)而促進(jìn)PM2.5侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β也可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放VEGF和胸苷磷酸化酶（TYMP）。VEGF與TYMP破壞緊密連接蛋白，增加血腦屏障通透性[16]。胎兒大腦的血腦屏障尚未完全發(fā)育成熟，來(lái)自于母鼠的PM2.5則更容易穿過(guò)血腦屏障致子代鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生炎癥因子損傷局部組織，并與釋放的損傷相關(guān)模式（DAMP）分子一起，進(jìn)一步增加炎癥和膠質(zhì)細(xì)胞激活，導(dǎo)致惡性的炎癥循環(huán)。這種長(zhǎng)期的炎癥可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成災(zāi)難性的后果，從突觸的喪失到認(rèn)知功能受損以及明顯的神經(jīng)變性[17]。由此說(shuō)明PM2.5可通過(guò)直接途徑作用于子代鼠CNS從而導(dǎo)致炎癥。

神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡是空氣污染可能對(duì)大腦產(chǎn)生不利影響的公認(rèn)的生物機(jī)制。本課題前期發(fā)現(xiàn)PM2.5劑量組神經(jīng)元逐漸減少，caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多，推測(cè)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NeuN/TUNEL、GFAP/TUNEL和Iba1/TUNEL雙陽(yáng)性細(xì)胞率均隨著PM2.5暴露劑量的增加而增加。雖然妊娠期暴露于PM2.5子代鼠腦細(xì)胞凋亡增多，但最終的結(jié)果星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞仍成激活狀態(tài)，炎癥因子呈高水平表達(dá)。已知PM2.5可通過(guò)增加活化的NF-κB和促炎細(xì)胞因子的水平，特別是TNF-α和IL-1β，來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞活化[18]。這與我們的研究結(jié)果妊娠期暴露于PM2.5子代鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和TNF-α、IL-1β和IFN-γ表達(dá)增多相一致。因此，我們推測(cè)妊娠期PM2.5暴露直接導(dǎo)致子代大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能是導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的主要途徑。

綜上所述，妊娠期暴露于PM2.5可在子代鼠大腦皮層引起以神經(jīng)細(xì)胞凋亡，膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥因子過(guò)多表達(dá)為特征的改變。因此，妊娠期暴露于PM2.5對(duì)胎兒神經(jīng)毒性應(yīng)引起人們的高度重視，針對(duì)妊娠期女性應(yīng)給予防護(hù)，不易長(zhǎng)時(shí)間暴露于PM2.5環(huán)境中。