李肖肖， 王達安， 陸大祥， 王華東， 魏 偉， 王彥平

(暨南大學基礎醫(yī)學院病理生理學系， 國家中醫(yī)藥管理局病理生理重點實驗室， 廣東 廣州 510632)

近年來研究發(fā)現，沙利度胺(thalidomide, THD)具有良好的抗肺纖維化作用[1-3]。有資料表明，沙利度胺抑制結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)過表達是其干預肺纖維化進展的重要環(huán)節(jié)之一[4-5]；我們曾報道，沙利度胺能抑制致纖維化細胞因子——轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)對人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblasts, HELF)中CTGF基因啟動子的激活[5]。DNA pull-down技術是用于分析基因啟動子與蛋白質相互作用的方法，本研究采用DNA pull-down技術，觀察TGF-β1對CTGF基因啟動子結合蛋白的影響及THD的拮抗效應，以探討THD抑制CTGF基因過表達的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

HELF細胞系、核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及蛋白質銀染試劑盒(南京凱基)；DMED細胞培養(yǎng)液(Gibco)；小牛血清(浙江天杭)；KOD-Plus (TOYOBO)；DM2000 DNA ladder(廣州美津)；pGL3-CTGFP質粒(本實驗室構建保存)；pRL-SV40質粒和螢光素酶檢測試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)；PCR產物抽提試劑盒(Biomiga)；GeneFinderTM核酸染料(廈門致善生物科技股份有限公司)；瓊脂糖(無錫耐思生物科技有限公司)；脂質體試劑盒(Polyplus-transfection)；人類重組TGF-β1(PeproTech)；PMSF、蛋白酶抑制劑cocktail和THD(Sigma)；PhosSTOP(Roche)；μMACS FactorFinder Kit(Miltenyi Biotec)。

2 方法

2.1TGF-β1對CTGF基因啟動子活性的影響及THD的干預作用分析 按每孔1×104個細胞將HELF細胞接種于含10%小牛血清、DMEM培養(yǎng)液的24孔培養(yǎng)板中，5% CO2、37 ℃中培養(yǎng)，待細胞生長至融合度約70%時，更換不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，重新更換全培養(yǎng)液，用脂質體將重組質粒pGL3-CTGFP轉染至培養(yǎng)的HELF細胞中，同時轉染含有海腎螢光素酶的pRL-SV40質粒作為內參照。培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為5 μg/L的TGF-β1，同時按分組加入終濃度分別為0、25、50和100 μg/L的THD，另外以相同培養(yǎng)方法但不添加TGF-β1和THD的細胞為空白對照組。所有細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收獲細胞，按Dual-Luciferase Reporter Assay System操作手冊，使用MD-SpectraMax M5多光譜微孔板閱讀器(Molecular Devices)在波長為560 nm和465 nm波長處檢測2種螢光素酶的發(fā)光值，以螢火蟲螢光素酶發(fā)光值/海腎螢光素酶發(fā)光值的比值 (F/R) 為相對螢光素酶活性，以反映CTGF基因啟動子的活性；每次每組3復孔，實驗重復3次。

2.2TGF-β1對CTGF基因啟動子結合蛋白影響及THD作用的分析

2.2.1生物素標記的CTGF啟動子探針(CTGFP-biotin探針)的制備 根據人類CTGF基因啟動子序列(GenBank登錄號AF316368，-964～+62)設計合成引物(由上海捷瑞合成)，5’端帶生物素標記的上游引物序列為5’-CTTCCCTTTTTCTGGAAACATTGATGG-3’，下游引物序列為5’-CTGACAGGGCGAGGAGGAGGAC-3’，以pGL3-CTGFP質粒為模板，通過PCR擴增獲取CTGFP-biotin探針，PCR產物長度為1 026 bp，反應條件：94 ℃預變性2 min; 94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)。擴增產物行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠并用PCR產物抽提試劑盒回收CTGFP-biotin探針，用核酸定量儀對回收產物進行DNA定量，分裝保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2細胞培養(yǎng)和處理 將HELF細胞接種于含10%小牛血清、DMEM培養(yǎng)液的150 mm培養(yǎng)皿中，每組3皿，3組共培養(yǎng)9皿細胞，細胞置5% CO2、37 ℃中培養(yǎng)，待細胞生長至融合度約70%時，更換不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，重新更換全培養(yǎng)液，按分組分別加入不同試劑，空白對照組(control group)：終濃度0 μg/L TGF-β1+0 μg/L THD，TGF-β1刺激組(stimulation group)：5 μg/L TGF-β1+ 0 μg/L THD和THD干預組(intervention group)：5 μg/L TGF-β1+50 μg/L THD，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收獲細胞。

2.2.3核蛋白的提取 上述細胞培養(yǎng)結束后按核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說明書，提取各組細胞核蛋白：胰酶消化后收集細胞，同組3皿細胞合并，細胞計數后取3×107個培養(yǎng)細胞，4 ℃、500×g離心3 min后棄上清, 按每20 μL細胞體積加入200 μL預冷Buffer A(含1∶100 PMSF、1∶500 cocktail和1∶10 PhosSTOP)，旋渦振蕩15 s，置冰上15 min后加入11 μL預冷Buffer B，旋渦振蕩5 s，放置冰上1 min，再次旋渦振蕩5 s，4 ℃、16 000×g離心5 min，將上清移出；在離心沉淀物中加入100 μL預冷Buffer C(含1∶100 PMSF、1∶500 cocktail和1∶10 PhosSTOP)，旋渦振蕩15 s，置冰上40 min，4 ℃、16 000×g離心10 min，取上清即為提取的核蛋白，定量后調整各組蛋白質濃度一致后保存在-80 ℃中備用。

2.2.4DNA pull-down實驗 參照μMACS FactorFinder Kit說明書，各組分別按如下步驟操作：每100 μL核蛋白提取物，加入200 μL Binding Buffer(每100 μL Binding Buffer含10 μL PMSF、2 μL cocktail、100 μL PhosSTOP和1 μL Binding Enhancer)，混勻后加入50 pmol CTGFP-biotin探針，室溫下孵育30 min，加入100 μL鏈親和素包被微珠，混勻后室溫下孵育10 min，用100 μL Washing Buffer-LS洗滌3次，再用100 μL Washing Buffer-HS洗滌3次，最后用50 μL Native Eluting Buffer洗脫磁珠上的結合蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5DNA pull-down產物的凝膠電泳分析 3組DNA pull-down產物行12% SDS-PAGE，電泳后按蛋白質銀染試劑盒說明書進行凝膠染色：用1∶4∶5體積比的冰醋酸、無水乙醇和去離子水在室溫下固定120 min，用1×敏化液作用60 min，去離子水漂洗后用Ag溶液在室溫下反應60 min，用去離子水漂洗后放入顯色液中反應6 min，再放入終止液中40 min，去離子水漂洗30 s,后用Tanon 5200化學發(fā)光成像分析儀 (上海天能) 采集圖像。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行檢驗，兩兩間比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 THD對TGF-β1誘導的HELF細胞中CTGF基因啟動子活性上調的影響

添加TGF-β1刺激組的相對螢光素酶活性明顯高于不加TGF-β1的空白對照組(P<0.01)；同時加入TGF-β1和不同濃度THD的各干預組，其相對螢光素酶活性均低于刺激組(P<0.01)，其中以添加THD終濃度為50 μg/L干預組的相對螢光素酶活性最低，其相對螢光素酶活性僅為刺激組的0.54倍。這一結果表明，TGF-β1能顯著上調HELF細胞中CTGF基因啟動子的活性，而THD能以劑量依賴方式抑制TGF-β1誘導的CTGF基因啟動子的激活,見圖1。

Figure 1. Effect of thalidomide (THD) on TGF-β1-induced activation ofCTGFgene promoter in HELF cell line. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group (without TGF-β1or THD)；△△P<0.01vsstimulation group (with TGF-β1alone).

圖1沙利度胺對TGF-β1誘導HELF細胞CTGF基因啟動子激活的影響

2 CTGFP-biotin探針瓊脂糖凝膠電泳結果

CTGFP-biotin探針的PCR擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳后，在1 000 bp左右位置(1 026 bp)顯示清晰條帶，與預期的擴增片段大小相符，提示CTGFP-biotin探針擴增成功,見圖2。

Figure 2. Gel electrophoresis of CTGFP-biotin probe amplified by PCR. Lane 1: PCR products; lane 2: DNA mar-ker.

圖2PCR擴增的CTGFP-biotin探針的凝膠電泳

3 DNA pull-down產物的凝膠電泳結果

DNA pull-down產物凝膠電泳及銀染結果共顯示5條分子量不等的蛋白質條帶(按分子量大小標記為①號～⑤號)，其中，空白對照組的②號和③號條帶呈現陽性，其余條帶在不同批次實驗中顯示為弱陽性或陰性；與空白對照組相比較，刺激組的①號、②號、④號和⑤號條帶灰度均有所增強(P<0.05)，而③號條帶減弱或陰性(P<0.05)；與刺激組相比較，干預組的①號、②號、④號和⑤號條帶灰度減弱或陰性(P<0.05)，而③號條帶則明顯增強(P<0.05)，見圖3。此結果表明TGF-β1能改變CTGF啟動子DNA上結合的蛋白質，而THD一定程度上能抑制該變化。

討 論

TGF-β 是肺纖維化啟動和發(fā)展中的關鍵性調控分子[6-7]，制約著肺纖維化的整個發(fā)展過程。人類的肺泡巨噬細胞、上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞等多種肺內的細胞都能分泌TGF-β，其中肺泡巨噬細胞和上皮細胞是分泌TGF-β的主要細胞，TGF-β主要通過自分泌和旁分泌機制發(fā)揮功能[8]；哺乳動物中存在TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β1β24種亞型，它們的結構具有高度同源性，生物學特性也基本相同，其中TGF-β1所占比例最高、活性最強、功能最多，也是致纖維化作用最突出的成分。研究表明，在肺纖維化動物模型及肺纖維化病人，肺組織或支氣管肺泡灌洗液中TGF-β均明顯增多[9]；作為強效的致纖維化細胞因子，TGF-β具有剌激肺成纖維細胞增殖及向肌成纖維細胞的轉分化，加速細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度分泌，抑制基質金屬蛋白酶活性從而減少ECM的降解，促進炎癥細胞產生釋放炎癥介質及促纖維化細胞因子，增加ECM受體的表達以促進ECM與細胞黏附等多方面作用[10-12]。因此，TGF-β一直被作為肺纖維化干預的重要靶標而開展了廣泛的研究，但TGF-β是一種多功能細胞因子，在胚胎發(fā)育、細胞外基質形成、骨骼重構、免疫調節(jié)以及神經系統(tǒng)的發(fā)育等多個方面發(fā)揮著重要的生理作用；有研究資料表明，敲除TGF-β1基因的小鼠因失去對炎癥的限制作用而在出生后很快死于全身性炎癥[13]。因此，直接阻斷TGF-β的治療策略可能會帶來許多難以預料的不良后果。

Figure 3. Influence of TGF-β1onCTGFpromoter-binding proteins and antagonistic effect of THD. Lane 1: marker of proteins; lane 2:control group; lane 3: stimulation group; lane 4: intervention group. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsstimulation group.

圖3TGF-β1對CTGF基因啟動子結合蛋白的影響及THD的干預作用

在尋找肺纖維化治療新靶點中，作為TGF-β轉導通路的下游信號分子，CTGF日益受到重視；CTGF是一種富含半胱氨酸、分子量為36～38 kD的分泌性多肽；正常情況下CTGF表達水平很低，CTGF的過度表達與肺纖維化的發(fā)病有密切關系。Allen等[14]和Pan等[15]發(fā)現，在特發(fā)性肺纖維化患者的肺泡灌洗液和纖維化肺組織中，CTGF的 mRNA和蛋白表達明顯上調，并且與反映纖維化程度的纖維連接蛋白表達水平呈正相關關系[16]；Xu等[17]報道，轉染含CTGF基因序列的表達質粒后，過表達CTGF能激活成纖維細胞中Ⅰ型膠原啟動子驅動的螢光素酶報告基因，表明CTGF與膠原合成密切相關。體外實驗表明， TGF-β1能夠誘導培養(yǎng)的肺成纖維細胞的CTGF表達增加[18]；而應用CTGF-siRNA能有效抑制TGF-β誘導的肺成纖維細胞增殖、表型轉化及ECM合成[19]。因此，目前認為在肺纖維化發(fā)病過程中，CTGF是介導TGF-β1促纖維化作用的重要下游介質；通常CTGF只介導TGF-β1的負面效應，TGF-β1的正面效應則由非CTGF途徑所介導[20]，拮抗CTGF不會出現阻斷TGF-β1后可能產生的負面臨床效應。因此，相比TGF-β1來說，通過阻斷CTGF達到的抗纖維化作用會更加特異和安全。

沙利度胺是具有抗肺纖維化開發(fā)潛力的藥物；Tabata等[21]報道，沙利度胺能明顯抑制博萊霉素誘導的小鼠肺組織Ⅰ型膠原α1的表達，減輕肺纖維化；Choe等[22]的研究表明，沙利度胺可抑制博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化模型支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞計數、TGF-β1和IL-6水平；臨床研究也表明，沙利度胺可提高肺間質纖維化患者的臨床治療總有效率、胸部CT病變吸收率和肺功能指標[23]。體外實驗顯示，沙利度胺對TGF-β1誘導的人胚肺成纖維細胞系HFLF轉分化為肌成纖維細胞的過程也有抑制作用，可抑制α-SMA和Ⅲ型膠原mRNA的表達[4]。我們曾報道，TGF-β1可上調HELF細胞CTGF基因啟動子活性，而沙利度胺具有抑制CTGF基因啟動子激活的作用[5]?；虻霓D錄調控是一個復雜、多因素參與的過程，DNA-蛋白質、蛋白質-蛋白質互相作用是其中重要的環(huán)節(jié)，細胞內發(fā)生的某些生物學事件(包括某些藥物的作用過程)有可能是通過各種具有轉錄激活或抑制作用的蛋白質相互作用，從而改變基因的表達狀態(tài)而實現的。2003年Yaneva[24]等創(chuàng)立了DNA pull-down方法，它基于DNA-蛋白質相互作用的原理，利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，采用磁珠分離技術，通過目的DNA調控序列探針與胞核蛋白反應而獲得參與基因轉錄調控的蛋白質信息；該方法具有重復性好、結合效率高、多級放大作用、操作簡便等優(yōu)點。為進一步了解TGF-β1激活CTGF基因啟動子的機制以及沙利度胺的干預效應，本研究嘗試采用DNA pull-down方法，將帶生物素標記的CTGF基因啟動子探針分別與空白處理、單純TGF-β1剌激和TGF-β1+THD作用下的HELF核蛋白提取物共同孵育，分離獲取不同狀態(tài)下與CTGF基因啟動子發(fā)生相互作用的蛋白質；實驗結果顯示，在TGF-β1刺激作用及THD干預情況下，CTGF啟動子的活性與CTGF基因啟動子結合蛋白改變存在相對應關系；與空白對照組相比較，TGF-β1刺激組出現了4條蛋白質條帶上調和1條蛋白質條帶下調，而在TGF-β1作用的同時給予THD的干預組與TGF-β1刺激組相比，4條上調的蛋白質條帶均減弱，而下調的蛋白質條帶又有所增強。這些結果提示沙利度胺可能是通過影響CTGF基因啟動子結合蛋白而達到拮抗TGF-β1誘導CTGF基因轉錄活性增強的作用。本實驗利用DNA pull-down技術初步分析了CTGF轉錄調控的機制，但實驗所發(fā)現的差異蛋白質尚需要作進一步的鑒定，各差異蛋白質在CTGF表達調控中所起的作用也有待今后深入的研究。這些研究或將有助于我們對沙利度胺抗肺纖維化作用機制的理解。