許 靜， 郭 哲， 王秋宇， 梁殿迅

(南陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科， 河南 南陽 473000)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率及致死率；且目前治療方式仍以放化療為主，而化療藥物的毒副作用及獲得性耐藥的出現(xiàn)成為影響治療效果及患者預(yù)后的主要因素[1-3]。目前關(guān)于腫瘤化療耐藥的研究多是從細(xì)胞分子水平尋找相應(yīng)的靶點，并探討其個性化治療的可行性[4]；而祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療復(fù)雜疾病上具有先天的優(yōu)勢，將其用于腫瘤的輔助治療可顯著改善患者預(yù)后，提高生存率[5]。紫草素(shikonin, SHI)是從天然紫草的根部提取出的一種脂溶性很強(qiáng)的萘醌類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗腫瘤等功能，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[6-7]。早期有研究顯示，紫草素可通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞H1975對?？颂婺岬墨@得性耐藥[8]；但其在婦科腫瘤中的應(yīng)用，目前仍需要大量的實驗驗證。本研究以人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及其順鉑(cisplatin,DDP)耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP為對象，評估紫草素對其順鉑耐藥的作用，并從細(xì)胞生長及凋亡的角度初步探討其潛在的作用機(jī)制，為紫草素在卵巢癌化療中的配伍使用提供實驗依據(jù)和一定的理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞為本實驗室自行凍存；細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone；紫草素購自Enzo Biochem；注射用順鉑購自齊魯制藥公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒購自廣州賴德公司；抗細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2, CDK2)、P18、p-Rb、Rb、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、caspase-3和β-actin抗體均購自江蘇碧云天公司；流式細(xì)胞周期檢測試劑盒及凋亡檢測試劑盒均購自南京凱基公司。

2 實驗方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及其順鉑耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素、1%鏈霉素，此外SKOV3/DDP細(xì)胞的培養(yǎng)基中需間斷性加入4 μmol/L順鉑以保證細(xì)胞的耐藥性。細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，并定期換液和傳代。

2.2細(xì)胞活力測定 采用CCK-8法測定經(jīng)不同處理后細(xì)胞活力的變化，將SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞按照每孔5 000個的密度接種至96孔板中，給予相應(yīng)的處理，并與藥物處理結(jié)束前2 h向每孔加入10 μL 的CCK-8試劑，然后將培養(yǎng)板重新置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀檢測培養(yǎng)板各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，計算細(xì)胞的相對活力。每組設(shè)置3個復(fù)孔取其均值，同時設(shè)只加入培養(yǎng)基的單孔作為空白對照。不同實驗的分組設(shè)置如下：為了確定順鉑對SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50，將順鉑的濃度梯度設(shè)置為0、3.13、6.25、12.5、25和50 μmol/L；為了確定紫草素的耐藥逆轉(zhuǎn)濃度，紫草素的濃度梯度設(shè)置為0、1、2、4、6、8和10 μmol/L。選取無細(xì)胞毒性作用的一組作為紫草素的耐藥逆轉(zhuǎn)濃度。

2.3細(xì)胞周期分布的檢測 依據(jù)公司提供的操作說明書進(jìn)行實驗，首先采用不加EDTA的胰酶消化并離心收集各組細(xì)胞，然后向細(xì)胞中加入70%的無水乙醇置于4 ℃避光固定過夜。離心洗去乙醇后避光加入碘化丙啶染液作用30 min，最后用流式細(xì)胞儀檢測Ex=488 nm處的熒光強(qiáng)度，分析各期的細(xì)胞百分比。實驗分組如下：對照(control)組，不加順鉑及紫草素；紫草素(SHI)組，紫草素濃度為4 μmol/L；順鉑(DDP)組,順鉑濃度為12.5 μmol/L；順鉑及紫草素聯(lián)用(SHI+DDP)組，順鉑濃度為12.5 μmol/L，紫草素濃度為4 μmol/L。

2.4細(xì)胞凋亡檢測 依據(jù)公司提供的操作說明書進(jìn)行實驗，首先采用不加EDTA的胰酶消化并離心收集各組細(xì)胞，然后向細(xì)胞中加入Binding Buffer重懸，先后加入Annexin V-FITC及碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液孵育，最后用流式細(xì)胞儀檢測各組在Ex=488 nm及 Em=530 nm處的熒光強(qiáng)度，分析其凋亡率。實驗分組同細(xì)胞周期檢測。

2.5Western blot檢測經(jīng)不同處理后細(xì)胞中細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的水平 RIPA(含cocktail)萃取各組細(xì)胞蛋白并定量，依據(jù)定量結(jié)果調(diào)整上樣蛋白量(80 μg)后進(jìn)行SDS-PAGE。待電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜。脫脂奶粉封閉PVDF膜后，按抗體說明書要求的比例孵育相應(yīng)的抗體。于暗室中顯影，曝光并沖洗膠片。蛋白表達(dá)采用ImageJ軟件行灰度半定量分析。實驗分組同細(xì)胞周期檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 紫草素及順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞活力的影響

本研究首先采用CCK-8法確定SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性，結(jié)果如圖1所示，順鉑可濃度依賴性抑制SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞的活力，其中順鉑對SKOV3細(xì)胞和SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50分別為(5.32±1.04) μmol/L和(22.51±3.15) μmol/L；SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑具有明顯的耐藥性，可用于后續(xù)實驗分析。

Figure 1. The effect of shikonin on the viability of cisplatin-resis-tant ovarian cancer SKOV3/DDP cells. Mean±SD.n=6.▽P<0.05vsSKOV3 group;△P<0.05vsSKOV3/DDP group.

圖1紫草素對卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP細(xì)胞活力的影響

CCK-8法細(xì)胞活力檢測的結(jié)果顯示，SKOV3/DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度的紫草素處理24 h后，細(xì)胞活力隨紫草素濃度的增加而有所降低，其中8 μmol/L及10 μmol/L的紫草素可顯著抑制細(xì)胞活力；處理48 h后，紫草素濃度在6 μmol/L、8 μmol/L及10 μmol/L時的作用較為顯著，后續(xù)實驗選取無抑制活力作用的濃度為紫草素的耐藥逆轉(zhuǎn)濃度，即4 μmol/L，見表1。

為進(jìn)一步檢測紫草素是否可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP的耐藥性，本研究采用CCK-8法檢測了預(yù)孵4 μmol/L紫草素之后，順鉑對SKOV3/DDP細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果顯示，經(jīng)過4 μmol/L紫草素預(yù)孵之后，SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性顯著增加，順鉑的IC50由(22.51±3.15)μmol/L降低至(13.43±3.24)μmol/L，見圖1。由此可見，紫草素可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP的耐藥性；且在順鉑濃度為12.5 μmol/L時，差異較為顯著，故而后續(xù)實驗選用此濃度進(jìn)行處理。

表1 紫草素對SKOV3/DDP細(xì)胞活力的影響

*P<0.05vs0 μmol/L group.

2 紫草素和順鉑聯(lián)用對SKOV3/DDP細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示，相比于對照組，順鉑處理組G0/G1期細(xì)胞所占百分比增加(P<0.05)，S期細(xì)胞所占百分比減少(P<0.05)；而紫草素和順鉑聯(lián)合處理組G0/G1期細(xì)胞所占百分比進(jìn)一步增加，S期細(xì)胞所占百分比進(jìn)一步降低，見圖2。這說明在SKOV3/DDP細(xì)胞中，相較于單用順鉑，紫草素和順鉑聯(lián)用可進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換。

3 紫草素和順鉑聯(lián)用對SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)及Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，相比于對照組，順鉑處理組細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P<0.05)；而加入4 μmol/L的紫草素預(yù)孵后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖3。這一結(jié)果說明紫草素可進(jìn)一步促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡。

4 紫草素和順鉑聯(lián)用對細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，相比于對照組，順鉑處理組細(xì)胞內(nèi)cyclin D1、CDK2、p-Rb及Bcl-2的蛋白水平有所降低(P<0.05)， P18、Bax 及cleaved caspase-3的蛋白水平則呈增加趨勢(P<0.05)；紫草素和順鉑聯(lián)合處理組的細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L紫草素孵育之后，cyclin D1、CDK2、p-Rb/Rb及Bcl-2的蛋白水平相比于DDP組顯著降低(P<0.05)； P18、Bax 及cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)相比于DDP組則進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖4。這一結(jié)果說明紫草素可影響SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)周期及凋亡相關(guān)因子的蛋白表達(dá)。

討 論

紫草素是從植物紫草中提取的中草藥提取物，具有抗腫瘤效應(yīng)，且自身毒副作用較小。本研究探究了紫草素對卵巢癌細(xì)胞化療耐藥性的影響，結(jié)果顯示紫草素可增加SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性，具有耐藥逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。腫瘤化療耐藥性的獲得機(jī)制較為復(fù)雜，但也是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。目前的研究顯示，腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力的增加是腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抗性一個重要原因[9-10]。故而本研究進(jìn)一步檢測了合用紫草素之后耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的細(xì)胞活力及凋亡情況，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示在SKOV3/DDP細(xì)胞中，相較于單用順鉑及紫草素和順鉑聯(lián)用均可進(jìn)一步抑制細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果提示紫草素逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP順鉑耐藥的機(jī)制包括促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長。

Figure 2. The effect of shikonin (SHI) on the cell cycle distribution of SKOV3/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.

圖2紫草素對SKOV3/DDP細(xì)胞周期的影響

Figure 3. The effect of shikonin (SHI) on the apoptosis of SKOV3/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.

圖3紫草素對SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The effect of shikonin (SHI) on the protein levels of cell cycle- and apoptotic-related molecules in the SKOV3/DDP cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsC group.

圖4紫草素對SKOV3/DDP細(xì)胞中細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)因子蛋白水平的影響

為進(jìn)一步研究紫草素對SKOV3/DDP細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本實驗采用Western blot檢測了周期及凋亡相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)。細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控點，正常情況下細(xì)胞周期蛋白可與周期蛋白依賴性激酶形成復(fù)合物，催化Rb的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期經(jīng)G0/G1期進(jìn)入S期完成DNA的復(fù)制；該過程則受到CDK抑制劑的負(fù)調(diào)控[11-12]。故此本實驗檢測了cyclin D1、CDK2、CDK抑制劑P18的蛋白表達(dá)以及Rb的磷酸化情況。結(jié)果顯示，相較于順鉑單處理組，紫草素和順鉑聯(lián)合處理組的細(xì)胞，cyclin D1、CDK2和p-Rb/Rb的蛋白水平顯著降低, P18的蛋白水平則進(jìn)一步增加。這提示紫草素可影響周期相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制SKOV3/DDP細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換。

細(xì)胞的凋亡大致可分為內(nèi)、外源2條途徑，但無論是何種凋亡途徑，最終都會伴隨caspase-3家族的激活[13]，本實驗的檢測結(jié)果也證實了紫草素可上調(diào)cleaved caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的凋亡。Bcl-2和Bax是B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2家族的2個有效成員，是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax發(fā)揮促凋亡作用，Bcl-2/Bax的比值決定了凋亡易感性，也是啟動細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14-15]。Bcl-2/Bax比值降低往往與腫瘤細(xì)胞的化療敏感性密切相關(guān)[16]。本實驗的檢測結(jié)果顯示，相較于順鉑單處理組，紫草素和順鉑聯(lián)合處理組的細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著降低；Bax的蛋白表達(dá)則進(jìn)一步增加；Bcl-2/Bax失平衡可能是紫草素促進(jìn)耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP凋亡的機(jī)制之一。

綜上所述，紫草素聯(lián)合順鉑使用可顯著提高卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP的化療敏感性，其作用機(jī)制可能是通過影響細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclin D1、CDK2、P18和p-Rb的蛋白水平，抑制細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換；同時下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞經(jīng)caspase-3發(fā)生凋亡，最終導(dǎo)致存活與凋亡的失平衡。