周 晗， 梁若龍， 王晗月， 胡巢鳳

(暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系， 國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510632)

自噬是一個(gè)受自噬相關(guān)基因嚴(yán)密調(diào)控的復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，基礎(chǔ)水平的自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的必要條件，然而自噬失調(diào)會(huì)打破細(xì)胞原有的平衡狀態(tài)，引發(fā)多種疾病的產(chǎn)生，如炎癥、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病等[1-2]。營(yíng)養(yǎng)缺乏、損傷、變性蛋白聚集和細(xì)胞器受損等應(yīng)激情況可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，細(xì)胞中大量游離的單層或雙層膜結(jié)構(gòu)聚集，包繞在待降解物的周圍，形成分隔膜，完全包繞待降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)形成雙層膜的自噬體。細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)將成熟的自噬體運(yùn)輸至溶酶體，二者融合形成自噬性溶酶體；自噬體內(nèi)容物在溶酶體蛋白水解酶的作用下消化、降解，細(xì)胞吸收并重新利用這些降解產(chǎn)物。該過(guò)程中出現(xiàn)的自噬體是自噬發(fā)生的典型特征[3]。

受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，Rip)是一類重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，通過(guò)與腫瘤壞死因子受體相互作用，介導(dǎo)下游核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路, 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和凋亡。Rip2屬于Rip家族成員，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，位于胞漿，在抵抗多種病原體入侵機(jī)體的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Rip2能誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1凋亡[5]。Rip2是否能直接誘導(dǎo)自噬至今未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究過(guò)表達(dá)Rip2對(duì)Panc-1細(xì)胞自噬的影響及其作用機(jī)制，為胰腺癌治療尋找新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

Panc-1細(xì)胞由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建；胎牛血清及DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME購(gòu)自Polyplus；抗Rip2多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、beclin-1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、p-Akt和GAPDH抗體均購(gòu)自CST。

2 方法

2.1Panc-1細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Panc-1細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)加入1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，第2天進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將Panc-1細(xì)胞分為對(duì)照(control)組：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，未給予任何處理； pEGFP-C2空質(zhì)粒(pEGFP-C2)組：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2空質(zhì)粒6 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)42 h；pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒(pEGFP-Rip2)組：轉(zhuǎn)染pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒6 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)42 h。

2.2Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 用含0.25% EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集Panc-1細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，向細(xì)胞沉淀加入RIPA裂解液100 μL和1 μL PMSF蛋白酶抑制劑，吹打混勻，置于冰上孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min, 收集上清, 并轉(zhuǎn)移到EP中。提取蛋白后吸取少量蛋白提取液, 用BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。

用SDS-PAGE分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再置于封閉液中進(jìn)行封閉1 h, 加Ⅰ抗體，4 ℃冰箱孵育12～16 h。滴加Ⅱ抗，TBST洗膜，曝光，用灰度分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行分析。

2.3透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量 將細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，按照上面的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞樣本，經(jīng)過(guò)戊二醛-鋨酸固定、梯度乙醇-丙酮脫水、浸透、Epon812包埋、高溫聚合、修塊、半薄切片、染色、定位、超薄切片和醋酸鈾-檸檬酸鉛染色等過(guò)程，將細(xì)胞樣本制作成為超薄切片，置于透射電子顯微鏡下，觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的變化并拍照記錄。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間均數(shù)的兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后Rip2蛋白的表達(dá)

pEGFP-C2空質(zhì)粒和pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-Rip2組細(xì)胞的Rip2蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01)；而對(duì)照組與pEGFP-C2組相比，Rip2蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并且上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Rip2蛋白的表達(dá)。

2 Rip2對(duì)自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)的影響

與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-Rip2組細(xì)胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；而對(duì)照組和pEGFP-C2組比較，beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

Figure 1. The expression of the Rip2 protein in Panc-1cells with different treatments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖1各組Panc-1細(xì)胞Rip2蛋白的表達(dá)

3 透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞內(nèi)自噬體的變化情況

pEGFP-C2空質(zhì)粒和pEGFP-Rip2重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞48 h后，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的變化情況。對(duì)照組、pEGFP-C2組和pEGFP-Rip2組的細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)自噬體，但對(duì)照組和pEGFP-C2組僅見(jiàn)少量自噬體，而pEGFP-Rip2組細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量明顯增加,見(jiàn)圖3。這一結(jié)果證明過(guò)表達(dá)Rip2可誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞發(fā)生自噬。

4 Rip2抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt/mTOR通路的活化

pEGFP-Rip2組細(xì)胞的p-Akt和p-mTOR蛋白水平明顯低于對(duì)照組和pEGFP-C2組(均P<0.01)；而對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，p-Akt和p-mTOR蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性； 各組總Akt和mTOR蛋白的水平未見(jiàn)明顯變化,見(jiàn)圖4。這一結(jié)果說(shuō)明Rip2可抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化。

Figure 2. The effect of Rip2 overexpression on the expression of beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2過(guò)表達(dá)Rip2對(duì)Panc-1細(xì)胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

討 論

自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著促進(jìn)和抑制的雙重作用，它既可以作為一種防御機(jī)制保護(hù)受損的細(xì)胞抵抗惡劣生存環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的生存，又可以在腫瘤細(xì)胞無(wú)法維持自身生存時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生殺傷性作用。自噬活性的變化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。

大量文獻(xiàn)報(bào)道Rip2與固有免疫、適應(yīng)性免疫和炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系，其中也有報(bào)道其與細(xì)胞凋亡和增殖有關(guān)[7]。那么，過(guò)表達(dá)Rip2是否對(duì)自噬有影響？Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30在哺乳動(dòng)物中的同源基因，它通過(guò)與激活PI3K形成復(fù)合物來(lái)調(diào)控其他自噬相關(guān)蛋白在自噬體膜上的定位和前自噬體的形成，是誘發(fā)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵基因之一[8-9]。Beclin1基因是第一個(gè)確認(rèn)的哺乳動(dòng)物的自噬基因，也是第一個(gè)確認(rèn)的在自噬溶酶體降解途徑中起腫瘤抑制的基因，對(duì)自噬體的形成至關(guān)重要[10]。LC3是定位于自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，有 LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 2種形式。LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定的存在于自噬體膜上，被當(dāng)做自噬體的標(biāo)記，并且LC3-Ⅱ的表達(dá)水平可以在一定程度上反映自噬體的數(shù)量[11]。我們通過(guò)Westernblot檢測(cè)各組Panc-1細(xì)胞beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示pEGFP-Rip2組細(xì)胞的beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和pEGFP-C2組，提示過(guò)表達(dá)Rip2可誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞發(fā)生自噬。

Figure 3. The changes of autophagosomes in Panc-1 cells under TEM (×8 900). A: control; B: pEGFP-C2; C: pEGFP-Rip2. M: mitochondrion; N: nucleus; arrow(→): autophagosomes

圖3透射電子顯微鏡下觀察Panc-1細(xì)胞內(nèi)自噬體的變化情況

自噬體的形成是自噬過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，因此，自噬的檢測(cè)方法主要包括基于檢測(cè)自噬體的直接(觀察自噬體的數(shù)量及形態(tài))和間接(檢測(cè)自噬體的表面標(biāo)記蛋白)方法。透射電子顯微鏡下觀察到雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體是檢測(cè)自噬的金標(biāo)準(zhǔn)，也是觀察細(xì)胞自噬最直接、最經(jīng)典的方法。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證過(guò)表達(dá)Rip2對(duì)Panc-1細(xì)胞自噬水平的影響，我們收集各組細(xì)胞并制作成超薄切片，在透射電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的變化情況。結(jié)果顯示對(duì)照組、pEGFP-C2組和pEGFP-Rip2組的細(xì)胞內(nèi)均有自噬體形成，但pEGFP-Rip2組細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量明顯多于對(duì)照組和pEGFP-C2組。因此證明過(guò)表達(dá)Rip2可直接誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞發(fā)生自噬。

細(xì)胞自噬的調(diào)控涉及多種復(fù)雜的信號(hào)通路，其中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞自噬活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，受營(yíng)養(yǎng)狀況、生長(zhǎng)因子和ATP等多種因素變化的影響，可使其下游靶蛋白發(fā)生磷酸化，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和調(diào)控自噬。研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)因子等通過(guò)受體酪氨酸激酶活化Ⅰ型PI3K，催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)， PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 (phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK-1)結(jié)合, 促使PDK1磷酸化Akt導(dǎo)致Akt活化，從而激活mTOR, 抑制自噬[12-13]。

Figure 4. The effect of Rip2 overexpression on the levels of p-Akt and p-mTOR proteins in Panc-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4過(guò)表達(dá)Rip2對(duì)Panc-1細(xì)胞p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平的影響

為了探究Rip2誘導(dǎo)自噬是否與PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)，我們應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白的水平。結(jié)果顯示pEGFP-Rip2組細(xì)胞的p-Akt蛋白水平明顯低于對(duì)照組和pEGFP-C2組，而各組總Akt蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。隨后，我們又檢測(cè)了Akt下游p-mTOR蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)pEGFP-Rip2組細(xì)胞p-mTOR的蛋白水平明顯低于對(duì)照組和pEGFP-C2組，而各組總mTOR蛋白水平無(wú)明顯變化。以上結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)Rip2可誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞發(fā)生自噬，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有關(guān)。

綜上所述，Rip2能夠誘導(dǎo)Panc-1細(xì)胞發(fā)生自噬；其作用機(jī)制可能與Rip2下調(diào)磷酸化Akt和mTOR的蛋白水平，進(jìn)而抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化有關(guān)。隨著進(jìn)一步探討Rip2誘導(dǎo)自噬的作用機(jī)制，將為臨床治療胰腺癌及其他腫瘤尋找新的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。