李尊元，李曉燕，趙 創(chuàng)，陳春蘭，李 淼，譚 倩，梁 薇，劉志丹△

(1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 201999；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院寶山分院，上海 201999；3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；4.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046)

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為對稱性、持續(xù)性多關(guān)節(jié)炎，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前現(xiàn)代醫(yī)學常用的RA治療藥物有抗風濕藥(DMARDs)、非甾體類抗炎藥(NSAIDs)、糖皮質(zhì)激素、生物制劑以及靶向小分子藥物等[2]。RA發(fā)病機制尚不明確，已發(fā)現(xiàn)炎癥因子及自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)紊亂在RA的發(fā)病中起重要作用。

類風濕關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學中屬“痹癥”?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺摗吩疲骸瓣枤庹撸珓t養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋?！薄肚Ы鸱健分杏涊d：“歷節(jié)風痛，但痛處灸二七壯，佳?！睆墓胖两竦奈墨I均記載，艾灸能治療包括類風濕關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的痹病?，F(xiàn)代研究顯示，艾灸能夠減輕RA患者臨床癥狀、改善生活質(zhì)量[3-6]，作為RA綜合治療方案的完善和補充，有著重要的意義。臨床上懸灸與直接灸是灸法實施的兩種不同方式，其治療RA的臨床療效均有文獻支持[7-10]。但運用動物模型研究艾灸療法治病機制的時候，有些研究運用直接灸(麥粒灸)[11-14]，有些運用懸灸[15-21]；那么究竟兩種艾灸方法在療效和機制上有何不同，是值得探討的重要問題。

本研究在CIA小鼠模型基礎(chǔ)上，比較了兩種不同灸法對于CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的干預(yù)效果，報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、飼養(yǎng)場所、醫(yī)學倫理

8～10周齡雄性DBA/1J小鼠36只，提供單位為南京生物醫(yī)藥研究院實驗動物中心，其許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。先將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，第1周后將其隨機分組，每組各6只，共計6組。將其中1組設(shè)為正常組，另外5組小鼠先混合，之后進行造模，待模型成功后，將其隨機分為模型組、安慰治療組、不治療組、懸灸組和直接灸組。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠各3只，采用自然光照，投放普通小鼠飼料，并定期清潔、消毒。本實驗研究中對動物的處置均按照國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》執(zhí)行。本研究動物實驗經(jīng)過寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會審核并取得倫理批件(201412-11)。

1.2 材料和試劑

本實驗采用的甲醛、無水乙醇、石蠟、氨水和二甲苯由上海國藥集團提供；牛Ⅱ型膠原由Chondrex公司提供；福氏完全佐劑(Freunds' Complete adjuvant,FCA)、福氏不完全佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant,IFA)由Sigma公司提供；蘇木素、伊紅由BASO公司提供；中性樹脂由上海長島生物技術(shù)有限公司提供；小鼠IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17及TGF-β酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒由Bio-swamp公司提供；淋巴細胞分離液由CEDARLANE公司提供；蛋白定量BCA試劑盒由南京建成公司提供；小鼠Anti-CD4 FITC、小鼠Anti-CD25 APC、鼠Anti-IL-17 PE、鼠Anti-FoxP3 PE由Ebioscienc公司提供;冰乙酸由上海試劑四廠提供。實驗中所有化學試劑均為分析純。

1.3 實驗儀器

石蠟切片機：徠克公司，SQ2125；攤片機：徠克公司，PPTHK-21B；酶標儀：芬蘭雷勃，MK3；CX41正置顯微鏡：OLYMPUS公司；酶聯(lián)免疫檢測儀：Bio- Rad公司，model 550； CO2恒溫培養(yǎng)箱：Thermo Forma公司，3111；低溫冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司，TG-16M；流式細胞儀：Bio- Rad公司，Accuri C6；數(shù)碼相機：NIKON公司；IMS圖象分析系統(tǒng)：基爾頓生物科技(上海)有限公司，D5100。

1.4 模型的建立

參照文獻[22]建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的類風濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型：Ⅱ型膠原(牛)溶解在濃度為0.05 mol/L的醋酸中，將其配制成2 mg/mL的膠原溶液，4℃過夜。用樣本均質(zhì)儀進行低速混合時，滴加等體積的FCA，配制終濃度為1 mg/mL的Ⅱ型膠原乳劑。以每只小鼠200 μL的劑量于尾根部皮下注射進行免疫。21天后再次在鼠尾基部皮內(nèi)注射100 μLⅡ型膠原乳劑進行二次免疫。以小鼠出現(xiàn)至少1只腿踝關(guān)節(jié)明顯紅腫為模型成功建立。

1.5 艾灸治療

參照文獻[23-26]中大鼠的取穴定位[腎俞：第2腰椎棘突下兩旁；足三里(后三里)穴：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下方]進行取穴，取穴后用記號筆在穴位處標記。將小鼠放入特制的艾灸裝置中，露出需要艾灸的穴位進行艾灸。選用45∶1精制艾絨作為艾灸材料，生產(chǎn)廠家:南陽艾顏堂艾絨有限責任公司。將精制艾絨制成1 mg/壯大小進行艾灸：懸灸組用鑷子將艾絨夾持并點燃，置于略高于動物穴位毛發(fā)處(避免燒傷皮膚)；直接灸組直接置于穴位毛發(fā)上(可能會造成一定程度的皮膚燒傷)。安慰治療組用醫(yī)用棉花制成上述艾絨同等大小，用上述方法進行艾灸。每只小鼠每穴艾灸6壯。連續(xù)治療6天為1個療程，共治療2個療程，兩個療程間休息2天。

1.6 關(guān)節(jié)腫脹度觀察

從艾灸治療第1天開始，每隔1天對發(fā)病的關(guān)節(jié)進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，一共觀察8次。評分標準參照文獻[27-28],0分:無紅斑、水腫；1分:兩只足小趾關(guān)節(jié)紅斑水腫；2分:全部趾關(guān)節(jié)或前腳掌紅斑水腫；3分：踝關(guān)節(jié)以下延伸到趾紅斑水腫；4分：踝關(guān)節(jié)至全爪紅腫或畸形。本評分標準最高分16分，關(guān)節(jié)炎指數(shù)為每只小鼠四肢評分的總和。根據(jù)觀察各次關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分結(jié)果，繪制出曲線圖。

1.7 取材及病理觀察

模型組的設(shè)立，是為說明CIA模型治療前的情況，該組小鼠造模成功后即予以處死并取材；不治療組不進行治療，目的為說明CIA小鼠未經(jīng)治療的15天后的情況，僅實施與艾灸組相同的抓取過程，將結(jié)果與艾灸組進行對比，成模15天后與懸灸組、直接灸組和安慰治療組一同處死、取材。

于艾灸組末次治療24 h后，用頸椎脫臼法處死各組小鼠，并于75%的酒精中浸泡10～15 min，然后取及和踝關(guān)節(jié)。脾臟經(jīng)剪碎、研磨，過200目細篩，用淋巴細胞分離液重懸、離心后吸取中間白膜層。該層即為脾單核細胞。加RMPI-1640培養(yǎng)基洗滌1次，加紅裂液，離心，再洗滌1次；洗滌結(jié)束后，細胞重懸，計數(shù)、定量、分管凍存。踝關(guān)節(jié)用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，矢狀面切片，常規(guī)HE染色。

1.8 ELISA

方法參照所購小鼠IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17及TGF-β酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒以及BCA蛋白定量試劑盒說明書。用酶標儀測定OD值(450 nm波長)。劃定標準曲線，計算上述指標的含量，統(tǒng)計分析。

1.9 流式細胞分析

Th17細胞檢測：調(diào)整細胞濃度(1×106個/mL)，接種24孔板，加佛10 ng/mL波醇乙酯(PMA)，1 μmol/L離子霉素和500 ng/mL蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑莫能菌素，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h；收集細胞、重懸；加anti-CD45 μL，4℃避光孵育1 h。設(shè)不加抗體作管為陰性對照。孵育結(jié)束，離心、沉淀、PBS洗、重懸、離心，棄上清；所有樣本離心、棄上清、洗兩次，細胞沉淀PBS重懸，加入IL-17抗體1 μL，4℃避光孵育1 h。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，上機檢測。

Treg細胞檢測步驟：調(diào)整細胞濃度(1×106個/mL)。每樣本設(shè)檢測管14個：陰性對照管：不加抗體，只加100 μL細胞懸液；同型對照管：加入細胞懸液100 μL和同型對照抗體5 μL；CD4單標管：加入細胞懸液100 μL和anti-CD4 5 μL；CD25單標管：加入細胞懸液100 μL和5 μL anti-CD25； Foxp3單標管：只加細胞懸液100 μL；CD4+CD25+FOXP3三標管：先加入100 μL細胞懸液，anti-CD4 5 μL，anti-CD25 5 μL，輕輕混勻；4℃避光孵育1～2 h。孵育1～2 h后，F(xiàn)oxp3單標管和CD4+CD25+FOXP3三標管進行離心、棄上清，細胞沉淀洗兩次，0.5 mL 1× Foxp3 FIX buffer重懸，4℃固定30 min；其他檢測管可進行上機檢測；固定結(jié)束后，F(xiàn)oxp3單標管和CD4+CD25+FOXP3三標管每管分別用0.5 mL 1× Foxp3 Permeabilization and Wash buffer洗滌兩次；洗滌結(jié)束后，F(xiàn)oxp3單標管和CD4+CD25+FOXP3三標管每管分別加入0.5 mL 1× Foxp3 Permeabilization和Wash buffer，放置4℃破膜30 min；然后，F(xiàn)oxp3單標管和CD4+CD25+FOXP3三標管每管分別加入Foxp3抗體5 μL；4℃避光孵育1 h。上機檢測步驟同Th17檢測。

1.10 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準差表示。計量資料數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布同時滿足方差齊性要求的，采用方差分析進行組間比較；不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)，則用非參數(shù)檢驗(秩和檢驗)進行分析。P≤0.05則認為有統(tǒng)計學意義。用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析計算。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)形態(tài)變化

如圖1所示：CIA模型建立后，模型組與正常組關(guān)節(jié)比較明顯紅腫。經(jīng)治療，懸灸組小鼠關(guān)節(jié)紅腫相對模型組有較明顯的消退；而安慰治療組和不治療組小鼠關(guān)節(jié)紅腫無明顯消退，直接灸組小鼠腫脹較前更加明顯。不治療組、懸灸組、直接灸組和安慰治療組4組小鼠關(guān)節(jié)評分組間差異經(jīng)重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較，從第4次開始差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)。根據(jù)圖2曲線變化及統(tǒng)計分析，可判斷第4～8次評分懸灸組小鼠關(guān)節(jié)評分均低于其它3組(P<0.05)。這表明懸灸對治療小鼠的關(guān)節(jié)腫脹有一定作用。

圖1 RA小鼠艾灸治療前后的關(guān)節(jié)腫脹變化及與正常爪的對比

圖2 艾灸組與對照組RA小鼠的關(guān)節(jié)評分曲線對比

2.2 關(guān)節(jié)病理分析

如封三彩圖3所示類風濕關(guān)節(jié)炎模型建立后(即模型組)，與正常組對比，關(guān)節(jié)面較正常組粗糙，且滑膜層變薄，經(jīng)過懸灸治療后，小鼠病變關(guān)節(jié)面恢復(fù)平整，滑膜層變厚，與正常組較為接近。而直接灸組，治療后粗糙的關(guān)節(jié)面有一定程度的恢復(fù)，但不如懸灸組恢復(fù)得好。而安慰治療組與模型組、不治療組比較變化不明顯(圖中方框所示為關(guān)節(jié)滑膜面)。

2.3 ELISA檢測脾細胞相關(guān)細胞因子表達

統(tǒng)計分析顯示：CIA模型小鼠脾臟中IL-1β、IL-6、IL-17等致炎因子表達增高(P=0.00)；懸灸和直接灸治療后上述致炎因子含量相應(yīng)降低(與模型組比較P=0.00)，且兩組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；安慰治療組、不治療組與模型組無顯著的統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。而抑炎因子IL-10、TGF-β在CIA模型小鼠脾臟中表達降低；懸灸和直接灸治療后它們的表達明顯提高(與模型組比較P=0.00)，且兩組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；安慰治療組、不治療組與模型組無顯著的統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠炎癥相關(guān)細胞因子表達比較單位:pg/mL)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

2.4 流式細胞術(shù)分析脾臟Th17、Treg細胞數(shù)量

統(tǒng)計分析顯示：與正常小鼠比較，CIA模型小鼠Treg細胞下降(P=0.00)；懸灸治療后，Treg細胞的數(shù)量有顯著上升(與模型組比較，P=0.00)；而直接灸對Treg細胞數(shù)量的影響無顯著差異(與模型組比較，P=0.22)。而安慰治療組和不治療組Treg細胞的數(shù)量與模型組無顯著差異(均P>0.05)。與正常小鼠比較，CIA模型小鼠Th17細胞上升(P=0.00)；懸灸治療后，Th17細胞的數(shù)量有顯著下降(與模型組比較，P=0.00)；而直接灸組Th17細胞數(shù)量的影響無顯著差異(與模型組比較，P=0.44)。而安慰治療組和不治療組Th17細胞的數(shù)量與模型組無顯著差異(均P>0.05)。見表2。

表2 流式細胞術(shù)分析各組Th17、Treg細胞數(shù)量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

這說明，懸灸能正向調(diào)節(jié)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中的Treg/Th17細胞失衡，提高Treg細胞、抑制Th17細胞數(shù)量，而直接灸作用不明顯。

3 討論

艾灸治療的施治方式、技術(shù)參數(shù)是影響療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來艾灸治療RA的實驗研究中，越來越多地關(guān)注了穴位的選擇[25]、灸溫[27]、時間[28-30]、方法[31]、距離[22]對實驗結(jié)果的影響，但對施灸方式異同的比較研究并不多見。既往研究艾灸治療RA的動物實驗中，有的研究采用麥粒灸，有的采用艾柱懸灸，兩種方式均有一定療效。那么到底直接灸和懸灸，哪種灸法治療RA模型動物更好，尚不明了。

回顧相關(guān)文獻，只有一項研究[31]在實驗中比較了溫和灸、隔姜灸和直接灸3種不同方法對RA模型兔關(guān)節(jié)炎的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種灸法均有明顯的抗炎作用，但療效上隔姜灸作用更明顯；不同灸法對下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(Hypothalamic Pituit Aryadvenal Axis, HPAA)功能均有明顯的調(diào)整作用，但不同灸法比較差異無統(tǒng)計學意義。該結(jié)果仍然無法回答直接灸和懸灸對于治療RA模型鼠尤其是CIA小鼠關(guān)節(jié)炎孰優(yōu)孰劣的問題。

本研究首次在CIA小鼠模型上比較了“腎俞”和“足三里”穴直接灸與懸灸治療的不同效應(yīng)，并用棉花灸作為安慰對照證實艾灸的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：直接灸和懸灸均能減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜病變、下調(diào)IL-1β、IL-6、IL-17等致炎因子和上調(diào)IL-10、TGF-β等抗炎細胞因子含量；說明兩者均有一定的療效。但也觀察到，與懸灸治療比較，直接灸治療對CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹有不減反增的作用，并且對于糾正脾Treg/Th17細胞失衡狀態(tài)無顯著作用。這說明懸灸和直接灸的效應(yīng)還是有不同之處的，直接灸治療CIA小鼠的療效和作用機理還需進一步研究。但也有研究[23-24]表明用麥粒灸直接灸療可改善實驗性RA大鼠足趾腫脹程度，其機制可能是通過改善滑膜組織增生與炎癥因子的凋亡。上述研究與本研究結(jié)果有所不同，可能與選擇的實驗?zāi)Ｐ拖嚓P(guān)。CIA小鼠關(guān)節(jié)較小，1 mg/壯的麥粒灸刺激量仍顯過大，也可能是導(dǎo)致腫脹不減反增的原因。

同時，還有一項研究[32]觀察了直接灸、溫和灸、隔姜灸3種不同灸法產(chǎn)生的“艾灸血清”的RA模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組RA滑膜成纖維細胞48 h后均狀態(tài)變好，形態(tài)逐漸接近于正常滑膜成纖維細胞，其中以隔姜灸組最為明顯。但該研究為艾灸后的產(chǎn)物——艾灸血清體外作用于培養(yǎng)的成纖維細胞的研究，又不能直接用于說明與其體內(nèi)的作用是同出一轍。但這項研究中隔姜灸法治療效果更好的發(fā)現(xiàn)與上述研究直接灸、溫和灸、隔姜灸一致，也提示應(yīng)該將直接灸、懸灸、隔姜灸用于CIA小鼠，進一步比較其異同。