劉海梅，陳 靜，郝良文，于 慧

牡蠣又名生蠔，是我國主要的經(jīng)濟(jì)貝類之一，也是我國四大養(yǎng)殖貝類之一[1]，營養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)，是一種高蛋白的食品[2-4]。已有研究學(xué)者利用其富含的蛋白質(zhì)制備酶解液，發(fā)現(xiàn)牡蠣酶解液具有一定的抗氧化活性[5-6]。美拉德反應(yīng)是廣泛存在于食品加工與貯藏過程中的一種非酶褐變反應(yīng)，其利用食品中存在的羰基（主要來源于糖或油脂氧化酸敗所產(chǎn)生的醛和酮）和氨基化合物（主要來源于胺、氨基酸、肽和蛋白質(zhì)）發(fā)生羰氨反應(yīng)，生成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）。MRPs不僅能提供給食品芳香風(fēng)味和色澤，而且具有抗氧化、抗誘變、抗病毒、抑菌、抗過敏、保護(hù)心血管疾病和預(yù)防腸道炎癥等生理功能[7-14]。已有研究表明，美拉德反應(yīng)能顯著增強(qiáng)肽和蛋白質(zhì)的抗氧化活性，木糖-草魚肽反應(yīng)的MRPs[15]、大豆分離蛋白和金帶細(xì)鲹魚肉蛋白酶解物與葡萄糖反應(yīng)生成的MRPs[16-17]等的抗氧化活性均高于相應(yīng)的肽和蛋白質(zhì)。因此，利用蛋白質(zhì)、肽、氨基酸和還原糖制備具有抗氧化活性的MRPs[18-21]已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，MRPs的抗氧化強(qiáng)度可以與食品中常用的抗氧化劑媲美[22]，一些MRPs可以替代酚類食用抗氧化劑[23-24]。MRPs是食品加工和貯藏過程中自身產(chǎn)生的一類物質(zhì)，被認(rèn)為是天然物質(zhì)，利用美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的抗氧化劑屬于天然抗氧化劑，尋找具有高活性的天然抗氧化劑代替商業(yè)抗氧化劑如叔丁基對(duì)羥基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，將極大地保障食品質(zhì)量與安全。MRPs的抗氧化活性會(huì)因美拉德反應(yīng)的反應(yīng)底物和反應(yīng)條件的不同而產(chǎn)生較大差異，本研究擬以牡蠣酶解液為原料，與葡萄糖建立美拉德反應(yīng)體系，優(yōu)化美拉德反應(yīng)體系的反應(yīng)條件，提高M(jìn)RPs的抗氧化活性，從而為天然抗氧化劑的開發(fā)和牡蠣深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣（Crassostrea gigas） 煙臺(tái)振華量販超市魯東大學(xué)店；Protemax復(fù)合蛋白酶（酶活力1.5 AU/g）諾維信憶諾聯(lián)創(chuàng)生物科技（北京）有限公司；葡萄糖上海市藍(lán)季生物有限公司；二甲基硅油 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

721G紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；AR224cn數(shù)顯電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DF-2集熱式恒溫磁力攪拌器（油浴鍋）金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠；TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；JJ-2B組織勻漿搗碎機(jī) 金壇市榮華儀器制造有限公司；PB-10普及型pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備流程

新鮮牡蠣肉→加水調(diào)整料液比為1∶5（m/m）→高速組織搗碎機(jī)搗碎→自然pH值→加入復(fù)合蛋白酶（30 AU/kg）→50 ℃恒溫酶解4 h→100 ℃滅酶15 min→冷卻→離心（5 000 r/min、15 min）→取上清液→酶解液[25]。

1.3.2 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MRPs抗氧化活性的影響

牡蠣酶解液中加入不同質(zhì)量的葡萄糖，使葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%，在自然pH值下100 ℃加熱反應(yīng)90 min，冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液，測(cè)定不同葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力。

1.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)MRPs抗氧化活性的影響

牡蠣酶解液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖，在自然pH值下，分別在90、100、110、120、130、140 ℃條件下加熱反應(yīng)90 min，冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液，測(cè)定不同反應(yīng)溫度MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力。

1.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs抗氧化活性的影響

牡蠣酶解液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖，在100 ℃、自然pH值下，分別加熱反應(yīng)30、60、90、120、150、180 min，冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間下MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力。

1.3.5 pH值對(duì)MRPs抗氧化活性的影響

牡蠣酶解液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖，分別調(diào)節(jié)pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在100 ℃下加熱90 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min。取上清液，測(cè)定不同pH值下MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力。

1.3.6 MRPs抗氧化活性為指標(biāo)的美拉德反應(yīng)條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)的因素水平如表1所示。

表1 美拉德反應(yīng)條件正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Code and level of independent variables used in orthogonal array design for Maillard reaction conditions

1.3.7 DPPH自由基清除率的測(cè)定

移取2 mL樣液，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻后于室溫下避光反應(yīng)30 min，測(cè)定在517 nm波長處的吸光度。將2 mL DPPH乙醇溶液與2 mL磷酸鹽緩沖液混合液作為對(duì)照組；2 mL樣品與2 mL乙醇混合液作為空白組[26]。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為對(duì)照組的吸光度。

1.3.8 金屬離子螯合能力的測(cè)定

移取2 mL樣液，加入2.7 mL蒸餾水和0.1 mL 0.02 mmol/L FeCl2溶液，再加入0.2 mL、5 mmol/L菲洛嗪溶液，在漩渦混合儀上混勻后室溫下反應(yīng)10 min，于562 nm波長處測(cè)定吸光度。用蒸餾水代替樣品溶液作為對(duì)照組，用蒸餾水代替菲洛嗪溶液作為空白組[27]。金屬離子螯合能力的計(jì)算如式（2）。

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為對(duì)照組的吸光度。

1.3.9 還原能力的測(cè)定

取樣液1 mL（體積分?jǐn)?shù)95%乙醇作為空白），加入2.5 mL 0.2 mol/L的pH 6.6磷酸鹽緩沖液與2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀的混合溶液，于50 ℃恒溫水浴30 min，再加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸，于3 000 r/min離心分離10 min，取上層清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min后，測(cè)定700 nm波長處吸光度，即為還原能力[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel、SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理及圖表的制作，采用最小顯著性差異法進(jìn)行方差分析，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MRPs抗氧化活性的影響

圖1 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)DPPH自由基清除率及金屬離子螯合能力的影響Fig. 1 Effect of glucose addition on DPPH free radical scavenging capacity and metal chelating ability

圖2 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)還原能力的影響Fig. 2 Effect of glucose addition on reducing power

如圖1、2所示，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MRPs抗氧化活性的影響呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力均為最低，分別是53.38%、10.54%、0.893。葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至4%時(shí)，3 種抗氧化活性指標(biāo)急劇增高，分別為63.50%、13.90%、1.229，繼續(xù)增加葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)至10%，3 種抗氧化活性指標(biāo)均逐漸減弱。經(jīng)過方差分析，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力顯著高于其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)（P＜0.05），且不同葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的MRPs抗氧化活性指標(biāo)均存在明顯差異。經(jīng)美拉德反應(yīng)后，MRPs的DPPH自由基清除率明顯高于韋海勝等[5]報(bào)道的牡蠣酶解液的26%，說明經(jīng)美拉德反應(yīng)后，產(chǎn)物的抗氧化活性明顯增加。

綜合分析，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除能力、金屬離子螯合能力以及還原能力均達(dá)到最大值，因此，適宜的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)MRPs抗氧化活性的影響

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)DPPH自由基清除率及金屬離子螯合能力的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on DPPH free radical scavenging capacity and metal chelating ability

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)還原能力的影響Fig. 4 Effect of reaction temperature on reducing power

溫度直接影響MRPs的抗氧化活性[26-28]。如圖3、4所示，溫度由90 ℃升至120 ℃時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力逐漸增加至最高值，分別達(dá)到81.8%、13.0%、1.250；繼續(xù)增加溫度至130、140 ℃時(shí)，3 種抗氧化活性指標(biāo)水平先降低再上升，但數(shù)值均低于120 ℃時(shí)。經(jīng)過方差分析，溫度為120 ℃時(shí)的MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力顯著高于其他溫度（P＜0.05），且不同溫度下的MRPs抗氧化活性指標(biāo)均存在明顯差異。章銀良等[29]發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，酪蛋白-木糖模式MRPs的DPPH自由基清除率增加。趙晶等[30]研究酪蛋白-葡萄糖MRPs、酪蛋白-乳糖MRPs產(chǎn)物抗氧化活性時(shí)也發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，MRPs的DPPH自由基清除率增加。本研究結(jié)果與報(bào)道基本一致。

綜合分析，在溫度為120 ℃時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力均達(dá)到最大值，因此，適宜的反應(yīng)溫度為120 ℃。

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs抗氧化活性的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率及金屬離子螯合能力的影響Fig. 5 Effect of reaction time on DPPH free radical scavenging capacity and metal chelating ability

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原能力的影響Fig. 6 Effect of reaction time on reducing power

如圖5、6所示，反應(yīng)時(shí)間從30 min延長至120 min時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力整體呈增加趨勢(shì)，在120 min時(shí)達(dá)到最大值，分別為84.09%、8.68%、1.216。但隨著反應(yīng)時(shí)間延長至150、180 min，DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力均不同程度下降。經(jīng)過方差分析，反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力、還原能力顯著高于其他時(shí)間的（P＜0.05），不同反應(yīng)時(shí)間下的DPPH自由基清除率均存在顯著差異（P＜0.05），反應(yīng)時(shí)間為30、180 min下的金屬離子螯合能力和還原能力沒有顯著差異（P＞0.05），其他不同反應(yīng)時(shí)間下均存在明顯差異。趙謀明等[15]研究木糖-草魚肽美拉德反應(yīng)體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，具有強(qiáng)還原性的物質(zhì)易在美拉德反應(yīng)中產(chǎn)生，但隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，長時(shí)間加熱可能會(huì)使此類物質(zhì)產(chǎn)生分解，從而導(dǎo)致MRPs還原能力增強(qiáng)趨勢(shì)變緩。本研究發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間加熱會(huì)引起強(qiáng)還原性物質(zhì)分解，從而導(dǎo)致MRPs還原能力有一定程度的降低。

綜合分析，在反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，MRPs的自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力達(dá)到最大值，因此，適宜的反應(yīng)時(shí)間為120 min。

2.4 反應(yīng)pH值對(duì)MRPs抗氧化活性的影響

圖7 pH值對(duì)DPPH自由基清除率及金屬離子螯合能力的影響Fig. 7 Effect of reaction pH on DPPH free radical scavenging capacity and metal chelating ability

圖8 pH值對(duì)還原能力的影響Fig. 8 Effect of reaction pH on reducing power

pH值是美拉德反應(yīng)的重要影響因素，能夠直接影響美拉德反應(yīng)的進(jìn)程[27,29]，從而影響抗氧化活性物質(zhì)的生成。如圖7、8所示，美拉德反應(yīng)體系的pH值由5.5上升至7.0，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力和還原能力隨pH值的增加整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，pH 7.0時(shí)達(dá)到最高，分別為76.54%、25.82%、1.259，pH值上升至8.0的過程中則不斷下降。經(jīng)過方差分析，pH 7.0時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力、還原能力顯著高于其他pH值（P＜0.05），pH 7.5、8.0下的DPPH自由基清除率不存在顯著差異（P＞0.05），除此之外，其他不同pH值下的DPPH自由基清除率均存在顯著差異（P＜0.05）；pH 5.5、6.5及pH 6.0、7.5下的金屬離子螯合能力不存在顯著差異（P＞0.05），但pH 6.0、7.5下的金屬離子螯合能力顯著高于pH 5.5、6.5；pH 5.5、6.5下的還原能力不存在顯著差異（P＞0.05），其他不同pH值下的還原能力均存在顯著差異（P＜0.05）。綜合分析，在pH 7.0時(shí)，MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力達(dá)到最大值，因此，適宜的反應(yīng)pH值為7.0。

2.5 以MRPs抗氧化活性為指標(biāo)的美拉德反應(yīng)條件的優(yōu)化

表2 以MRPs抗氧化活性為指標(biāo)的美拉德反應(yīng)條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental values of antioxidant activity

對(duì)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及pH值進(jìn)行4 因素3 水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化，經(jīng)極差分析得到各因素對(duì)MRPs抗氧化活性的影響。由表2可知，對(duì)DPPH自由基清除率而言，各因素對(duì)抗氧化活性影響的大小順序?yàn)锽＞C＞A＞D，最優(yōu)條件為A2B2C2D3，即葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、反應(yīng)溫度120 ℃、pH 7.0、反應(yīng)時(shí)間150 min；對(duì)于金屬離子螯合能力而言，各因素對(duì)抗氧化活性影響的大小順序?yàn)镈＞A＞C＞B，最優(yōu)條件為A1B3C2D2，即葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、反應(yīng)溫度130 ℃、pH 7.0、反應(yīng)時(shí)間120 min；對(duì)于還原能力而言，各因素對(duì)抗氧化活性影響的大小順序?yàn)锳＞C＞B＞D，最優(yōu)反應(yīng)條件為A3B3C3D2，即葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、反應(yīng)溫度130 ℃、pH 8.0、反應(yīng)時(shí)間120 min。綜合分析葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及pH值4 個(gè)因素對(duì)MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力、還原能力3 個(gè)抗氧化活性指標(biāo)的影響，確定抗氧化活性最強(qiáng)的反應(yīng)條件為A2B2C2D2，即葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、反應(yīng)溫度120 ℃、pH 7.0、反應(yīng)時(shí)間120 min。

2.6 抗氧化活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在牡蠣酶解液中添加4%的葡萄糖，調(diào)整pH值為7.0，于120 ℃下進(jìn)行美拉德反應(yīng)120 min后，得到MRPs，測(cè)定其DPPH自由基清除率為93.2%，金屬離子螯合能力為22.5%，還原能力為1.436，優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果，證明選擇優(yōu)化的結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

牡蠣酶解液與葡萄糖建立美拉德反應(yīng)體系，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間4 個(gè)因素對(duì)MRPs的DPPH自由基清除率、金屬離子螯合能力以及還原能力的影響，優(yōu)化了MRPs產(chǎn)生較強(qiáng)抗氧化活性的條件，反應(yīng)條件為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、反應(yīng)溫度120 ℃、pH 7.0、反應(yīng)時(shí)間120 min。在此條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，得到的MRPs的DPPH自由基清除率為93.2%、金屬離子螯合能力為22.5%、還原能力為1.436。