袁江蘭，陳曉敏，鐘文秀，康 旭

傳統(tǒng)醬油是以大豆、小麥和麩皮為原料釀造而成的調(diào)味品，其滋味鮮美，深受消費(fèi)者歡迎。長(zhǎng)期以來，大豆是生產(chǎn)醬油的不可或缺的主要原料，但是隨著蛋白質(zhì)資源和醬油新產(chǎn)品的開發(fā)，一些高蛋白植物性原料，如玉米渣、核桃餅、面筋、米渣等成為釀造醬油的潛在資源[1-3]。

米渣是大米淀粉糖企業(yè)的主要副產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)60%左右，是濃縮的大米蛋白，具有氨基酸組成及比例合理、低抗原性等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，大米蛋白經(jīng)適度降解后還具有一定的保健功能，如抗高血壓、降低膽固醇等[6]。米渣溶解性很差，因此應(yīng)用非常有限，目前主要作為飼料，價(jià)值未得到充分體現(xiàn)。這一問題也引起了研究者的關(guān)注，近年來對(duì)其應(yīng)用研究較多，主要集中在蛋白粉、活性肽、可食用膜及食品添加劑等方面[7-9]。米渣是釀造醬油的優(yōu)質(zhì)原料[10]，但仍然存在蛋白質(zhì)利用率相對(duì)較低、風(fēng)味不及大豆醬油等問題；多菌種耦合發(fā)酵是解決這些問題的有效方法，如魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）耦合發(fā)酵能賦予醬油良好滋味和香氣，細(xì)胞自溶后也可進(jìn)一步增加醬油鮮味，魯氏酵母還可能對(duì)醬油的抗氧化活性產(chǎn)生貢獻(xiàn)。關(guān)于大豆醬油的抗氧化活性已有較多報(bào)道[11-15]，前期研究表明米渣醬油也具有明顯的抗氧化活性[10]，但其與菌種的相關(guān)性尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)探究魯氏酵母對(duì)米渣生醬油風(fēng)味和抗氧化活性的影響，以期為提高米渣的應(yīng)用價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉HN3.042、黑曲霉AS3.350 上海佳民釀造食品有限公司釀造一廠；魯氏酵母 安琪酵母股份有限公司。

米渣 湖北德安府糖業(yè)有限責(zé)任公司；仲辛醇（色譜純）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、羅丹明6G（高級(jí)純） Aladdin試劑（上海）有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀、F-7000熒光分光光度計(jì)日本日立公司；2100可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；78-1 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 米渣生醬油樣品的制備

將米渣、麩皮、面粉、水以質(zhì)量比6∶2∶2∶7.8的配比混合，經(jīng)蒸料、冷卻、接種后，在32～35 ℃、相對(duì)濕度85%～90%的恒溫恒濕曲室中制曲36 h。制曲結(jié)束后，稱取成曲，裝入1 L密封罐中，添加2.5 倍質(zhì)量鹽水混合制成鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.86%的稀醪，35 ℃恒溫發(fā)酵45 d，經(jīng)過濾得生醬油。根據(jù)菌種及接種比例差異，實(shí)驗(yàn)分組如下。

S1：接種0.2%米曲霉制曲；S2：接種0.16%米曲霉和0.04%黑曲霉，混菌制曲；S3：接種0.2%米曲霉制曲，發(fā)酵初始添加0.05%魯氏酵母混菌發(fā)酵；S4：接種0.16%米曲霉和0.04%黑曲霉混菌制曲，并在發(fā)酵初始添加0.05%魯氏酵母混菌發(fā)酵。

采用米曲霉（0.16%）和黑曲霉（0.04%）混菌制曲，制曲完成后，將成曲均分為3 份。C1：不添加魯氏酵母的對(duì)照組；C2：發(fā)酵初始時(shí)添加0.05%魯氏酵母；C3：醬醪發(fā)酵至pH 5.0時(shí)添加0.05%魯氏酵母。

采用米曲霉（0.16%）和黑曲霉（0.04%）混菌制曲，制曲完成后，將成曲均分6 份，醬醪發(fā)酵至pH 5.0左右時(shí)分別添加0.00%、0.01%、0.025%、0.05%、0.075%和0.100%魯氏酵母繼續(xù)發(fā)酵，記為Ⅰ～Ⅵ組。

1.3.2 基本理化指標(biāo)測(cè)定

氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛滴定法測(cè)定，參考GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》，還原糖含量測(cè)定參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》。

1.3.3 游離氨基酸含量測(cè)定

采用L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定生醬油中游離氨基酸含量。取適量生醬油樣品與等體積的10%磺基水楊酸溶液，混合均勻后于4 ℃下放置15 min，15 000 r/min離心15 min。取上清液用0.02 mol/L鹽酸稀釋200 倍，0.22 μm微孔濾膜過濾后上氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。衍生化試劑為茚三酮，反應(yīng)柱柱溫135 ℃，柱壓0.982 MPa。

1.3.4 總酚含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]方法，略作修改。取1 mL樣品稀釋液加6 mL蒸餾水和1 mL福林-酚試劑混勻后，在5～8 min內(nèi)加1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% Na2CO3溶液，混勻后，75 ℃水浴保持2 h后在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中總酚含量以沒食子酸含量表示。

1.3.5 揮發(fā)性成分分析

5-甲基-2-乙基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮（2-ethyl-4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone，EHMF）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）質(zhì)量濃度采用頂空固相微萃取和GC-MS測(cè)定。

固相微萃取方法：取3 mL醬油樣品與2 mL蒸餾水于20 mL樣品瓶中，加入2 g NaCl，置于磁力攪拌器50 ℃水浴平衡15 min后，用固相微萃取頭萃取，頂空吸附35 min，解吸5 min，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

GC條件：19091S-433UI HP-5MS Ultra Inert型毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速1.0mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流；升溫程序?yàn)槌鯗?0 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速率升溫到120 ℃保持2 min，再以7 ℃/min的速率升溫到220 ℃保持5 min。

MS條件：采集方式為掃描；溶劑延遲7 min；質(zhì)量范圍35～395 amu；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式EI；離子源能量70 eV；接口溫度250 ℃。

對(duì)匹配度大于70（最大值100）的揮發(fā)性成分根據(jù)NIST 11和NIST EPA數(shù)據(jù)庫定性，采用面積歸一化法進(jìn)行定量計(jì)算。

1.3.6 體外抗氧化活性測(cè)定方法

1.3.6.1 還原力

采用普魯士藍(lán)法[17]，以VC溶液的還原力作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)還原力進(jìn)行定量，表示為每毫升樣品的還原力與VC溶液濃度的等同量，即μg VC/mL。

1.3.6.2 DPPH自由基清除能力

參考文獻(xiàn)[18]的方法。樣品稀釋200 倍進(jìn)行測(cè)定并以VC溶液為陽性對(duì)照。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A樣品為等體積樣品稀釋液和DPPH乙醇溶液的吸光度；A對(duì)照為等體積樣品稀釋液和無水乙醇的吸光度；A空白為等體積水和DPPH乙醇溶液的吸光度。

測(cè)定5 個(gè)濃度梯度的樣品對(duì)DPPH自由基清除能力，經(jīng)線性回歸后計(jì)算出DPPH自由基清除能力為50%時(shí)的醬油濃度，即半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）（μL醬油/mL溶液）。

1.3.6.3 總抗氧化能力

采用ABTS法[19]，取2 mmol/L ABTS溶液50 mL與70 mmol/L K2S2O8溶液200 mL混合均勻，室溫避光放置12～16 h，得ABTS儲(chǔ)備液。用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）將ABTS儲(chǔ)備液稀釋，使其A734nm＝0.700±0.020。取0.2 mL樣品稀釋液與3.8 mL ABTS工作液混合均勻反應(yīng)4 min后檢測(cè)其A734nm，ABTS+·清除能力與A734nm呈反比。以Trolox為陽性對(duì)照，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的總抗氧化能力用Trolox當(dāng)量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示。

1.3.6.4 ?OH清除能力

采用羅丹明6G-Fenton體系熒光法[17]，在10 mL具塞比色管中，依次加入pH 4.8的磷酸鹽緩沖液0.5 mL 0.1 mg/L羅丹明6G溶液0.5 mL、1.0 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、0.03% H2O2溶液0.6 mL，加水至刻度，混勻，反應(yīng)15 min。激發(fā)波長(zhǎng)348 nm，發(fā)射波長(zhǎng)550 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm，以不加Fenton試劑的體系為空白，其熒光強(qiáng)度為F0，0.3 mL樣品稀釋液與羅丹明6G-Fenton溶液體系的熒光強(qiáng)度記為F樣品，未加清除劑體系的熒光強(qiáng)度記為F，并以0.53 mg/mL VC溶液作陽性對(duì)照。?OH清除能力按式（2）計(jì)算。

式中：F樣品－F為樣品清除6G-Fenton體系?OH的量；F0－F為羅丹明6G-Fenton體系所產(chǎn)生的?OH的量。

1.3.7 生醬油組分的抗氧化活性測(cè)定

提取醬油色素[20]，生醬油與無水乙醇最佳體積比為1∶2.16，按1.3.6.2節(jié)方法測(cè)定DPPH自由基清除活性。

采用蒸餾萃取法提取生醬油揮發(fā)油，按1.3.6.2節(jié)方法測(cè)定DPPH自由基清除活性。

采用超濾膜分離技術(shù)截留分子質(zhì)量小于10 kDa組分制成凍干粉，按1.3.6.2節(jié)方法測(cè)定DPPH自由基清除活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Origin 9.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析，顯著性分析采用SPSS 19.0軟件的Duncan test進(jìn)行，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 米渣生醬油品質(zhì)指標(biāo)和抗氧化成分

表1 米渣生醬油關(guān)鍵質(zhì)指標(biāo)和抗氧化活性成分Table 1 Quality indicators and antioxidant components of raw soy sauces

由表1可知，S1～S4氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度均明顯高于GB/T 18186—2000《釀造醬油》中特級(jí)醬油（0.8 g/100 mL），以添加黑曲霉發(fā)酵的S2和S4醬油中的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度最高，黑曲霉和米曲霉的協(xié)同作用提高了米渣蛋白的降解與轉(zhuǎn)化率。除還原糖外，其他各項(xiàng)指標(biāo)均以S4最高。黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶和淀粉酶的能力較強(qiáng)，有利于提高醬油中氨基酸態(tài)氮、總氨基酸含量、谷氨酸及還原糖的含量[22]。EHMF、4-VG是醬油中重要的特征香氣成分，其中，EHMF被認(rèn)為是日式醬油中最芳香的成分之一[23-25]。4-VG可賦予醬油典型的醬香味，EHMF具有焦糖香味，同時(shí)還具有抑制腫瘤和抗氧化功能。EHMF由魯氏酵母、假絲酵母等經(jīng)戊糖磷酸途徑或基于戊糖的美拉德反應(yīng)而生物合成[26-27]。S3、S4的總氨基酸、谷氨酸、EHMF和4-VG質(zhì)量濃度總體顯著高于S1、S2，表明魯氏酵母不僅與EHMF和4-VG的生物合成具有相關(guān)性，而且有利于提高發(fā)酵產(chǎn)品氨基酸質(zhì)量濃度。

C2、C3的各項(xiàng)指標(biāo)總體明顯高于C1（P＜0.05），尤以C3增加最為明顯，其中C3的EHMF和4-VG分別比C2約提高38.15%和33.98%。魯氏酵母最適pH值為4.5～5.0，米渣醬醪發(fā)酵初始pH值為5.83±0.05，對(duì)酵母生長(zhǎng)繁殖和代謝有一定抑制作用，酵母易因高濃度鹽水而失活或自溶，醬醪中活酵母數(shù)量下降。

酵母接種量對(duì)氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度影響不明顯，總氨基酸、谷氨酸、抗氧化氨基酸和總酚質(zhì)量濃度隨酵母添加量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，總氨基酸以Ⅲ為最高，Ⅱ和Ⅲ的谷氨酸、抗氧化氨基酸、總酚質(zhì)量濃度均較高，表明魯氏酵母添加0.01%～0.025%較為適宜。EHMF和4-VG質(zhì)量濃度均隨酵母添加量增加而增加，均明顯高于未添加組。

2.2 米渣生醬油揮發(fā)性成分

圖1 米渣生醬油主要揮發(fā)性成分Fig. 1 Major volatile components in raw soy sauces

由圖1可知，S1～S4的揮發(fā)性成分種類和質(zhì)量濃度均有一定的差異，以S3的揮發(fā)性成分種類為最多，達(dá)57 種，其次是S4，但S4揮發(fā)性成分總質(zhì)量濃度最高，約1 074.79 ng/mL，表明魯氏酵母耦合發(fā)酵顯著增加了風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量。各樣品均以醛類物質(zhì)質(zhì)量濃度最高，S4的醛類物質(zhì)質(zhì)量濃度較S1提高了41.4%，其中對(duì)醬油風(fēng)味有著關(guān)鍵作用的苯甲醛和苯乙醛質(zhì)量濃度提高最為顯著，S4苯甲醛和苯乙醛較S1分別提高了72.47%和44.13%。苯乙醛及其相應(yīng)的醇2-苯基乙醇來源于苯丙氨酸，事實(shí)上，蛋白質(zhì)的新陳代謝和游離氨基酸的變化在醬油香氣的形成中扮演著重要的角色[28]，這可能也意味著魯氏酵母在氨基酸代謝方面的特點(diǎn)。S3、S4酸類物質(zhì)質(zhì)量濃度均顯著高于相應(yīng)未添加魯氏酵母組，表明魯氏酵母明顯提高了醬油中的酸類物質(zhì)質(zhì)量濃度。

2.3 米渣生醬油體外抗氧化活性

圖2 米渣生醬油的體外抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activity of raw soy sauces

由圖2可知，S3、S4的4 種體外抗氧化活性均明顯高于相應(yīng)的對(duì)照S1、S2，表明魯氏酵母在抗氧化活性方面具有一定作用。在其他發(fā)酵產(chǎn)品中酵母菌也表現(xiàn)出對(duì)抗氧化活性有突出貢獻(xiàn)[29]。魯氏酵母除了產(chǎn)生高濃度的多元醇外，還具有較強(qiáng)抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑的來源[30]。可見魯氏酵母在耦合發(fā)酵醬油的過程中具有多方面的有益作用。

圖3 酵母接種時(shí)期對(duì)米渣生醬油抗氧化活性的影響Fig. 3 Effect of Z. rouxii inoculation time on antioxidant activity of raw soy sauce

由圖3可知，魯氏酵母接種時(shí)期對(duì)米渣醬油的抗氧化活性也有影響。C2和C3的抗氧化活性均明顯高于C1，特別是C3顯著增加，還原力較C2醬油提高了約14.49%，DPPH EC50為3.17 μL/mL。因此當(dāng)醬醪發(fā)酵至pH 5.0左右時(shí)添加魯氏酵母有利于提高米渣醬油的抗氧化活性。

由圖4A可知，與Ⅰ組相比，發(fā)酵初始7 d內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組還原力迅速增加，且與魯氏酵母添加量存在明顯的量效關(guān)系。發(fā)酵1 周后，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的還原力增加明顯變緩，而Ⅰ和Ⅱ還原力依然平穩(wěn)增加。還原力明顯受魯氏酵母添加量影響。由圖4B可知，魯氏酵母對(duì)DPPH自由基清除能力影響規(guī)律相似，發(fā)酵初始15 d，DPPH自由基清除率與魯氏酵母添加量呈正相關(guān)。表明抗氧化能力的增加與魯氏酵母的增殖和代謝有關(guān)，魯氏酵母的細(xì)胞數(shù)量和代謝產(chǎn)物對(duì)抗氧化有重要貢獻(xiàn)。

圖4 發(fā)酵期間米渣生醬油抗氧化活性的變化Fig. 4 Change in antioxidant activity of raw soy sauce during fermentation

2.4 醬油各組分的抗氧化活性

圖5 米渣生醬油組分（A）及還原型GSH（B）的DPPH自由基清除活性Fig. 5 DPPH radical scavenging effect of volatile oil, pigment and retenate with molecular mass less than 10 kDa from raw soy sauce (A)and reduced GSH (B)

如圖5A所示，在實(shí)驗(yàn)添加量范圍內(nèi)，揮發(fā)油與DPPH自由基清除率在明顯的量效關(guān)系，體積分?jǐn)?shù)低于2.5%時(shí)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，體積分?jǐn)?shù)2.5%時(shí)DPPH自由基清除率可達(dá)（89.13±0.73）%。米渣醬油色素主要通過褐變反應(yīng)產(chǎn)生，在實(shí)驗(yàn)添加量范圍內(nèi)醬油色素與DPPH自由基清除能力存在線性關(guān)系，當(dāng)色素質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)（89.42±0.49）%。隨著醬油色素質(zhì)量濃度增加，電子供體濃度增大，可結(jié)合更多的自由基形成穩(wěn)定物質(zhì)，從而中斷了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[31]。截留分子質(zhì)量小于10 kDa的醬油組分凍干粉和DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，但是相同質(zhì)量濃度下，還原型GSH清除DPPH自由基的能力明顯強(qiáng)于凍干粉。綜合分析表明米渣醬油揮發(fā)油、色素和較小的分子中均存在抗氧化活性成分，對(duì)米渣醬油抗氧化能力有重要貢獻(xiàn)。

3 結(jié) 論

魯氏酵母聯(lián)合曲霉發(fā)酵對(duì)增強(qiáng)米渣醬油風(fēng)味和抗氧化活性有利，總氨基酸和揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度均明顯增加，特別是谷氨酸、EHMF和4-VG質(zhì)量濃度增加顯著，同時(shí)各種體外抗氧化能力也得到明顯增強(qiáng)，有效改善了米渣醬油的品質(zhì)。

利用魯氏酵母發(fā)酵米渣醬油，需掌握適宜的接種量和接種時(shí)間，在發(fā)酵至醬醪pH 5.0左右時(shí)添加約0.025%的魯氏酵母為宜。

米渣醬油抗氧化的化學(xué)本質(zhì)并未探明，但初步的研究表明其揮發(fā)性成分、色素和截留分子質(zhì)量小于10 kDa的組分具有較強(qiáng)的抗氧化活性。