于衛(wèi)東，趙穎，譚光明，李守杰，李曉賽，查玉梅，侯為開

(1沂水縣人民醫(yī)院，山東沂水276400；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

糖尿病患者易較早出現(xiàn)白內(nèi)障，且病情進展迅速。長期高血糖可刺激機體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)發(fā)生非酶糖基化，引起多種異構(gòu)體在人體內(nèi)發(fā)生蓄積，臨床上將其稱為糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[1]。AGEs能與細胞膜上的糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合，促進糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生與發(fā)展[2,3]。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是一種調(diào)節(jié)細胞生長和分化的多肽，可通過影響晶狀體上皮細胞引起晶狀體前、后囊膜下發(fā)生纖維化，在白內(nèi)障的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[4]。2014年11月～2016年12月，本研究觀察了糖尿病并發(fā)白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織TGF-β表達、血清AGEs水平變化，現(xiàn)分析兩者在糖尿病并發(fā)白內(nèi)障中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期沂水縣人民醫(yī)院收治的糖尿病并發(fā)白內(nèi)障患者20例作為觀察組，男13例、女7例，年齡60～83(70.46±4.56)歲，糖尿病病程5～14(9.68±3.14)年，白內(nèi)障病程1～7(4.15±1.04)年。納入標準：①符合WHO 1998年制定的2型糖尿病診斷標準；②符合白內(nèi)障診斷標準，即晶狀體發(fā)生變性和混濁，變?yōu)椴煌该?，以致影響視力。排除標準：①合并惡性腫瘤或嚴重心、肝、腎功能不全者；②合并其他眼部疾病者。選擇同期收治的單純白內(nèi)障患者20例作為對照組，男11例、女9例，年齡61～84(69.73±4.49)歲，白內(nèi)障病程1～8(4.01±1.00)年。對照組白內(nèi)障診斷明確，空腹血糖均在正常范圍(3.9～6.1 mmol/L)。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，患者及其家屬均知情同意。

1.2 晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達檢測 采用Dot blot法。兩組入院第二天均行常規(guī)白內(nèi)障超聲乳化人工晶狀體移植術(shù)，術(shù)中取出晶狀體囊膜。利用撕囊鑷將其撕開，獲得直徑為5～7 mm的前囊膜組織，立即將其放入含RNase酶的EP管中，- 80 ℃保存?zhèn)溆?。取出部分保存?zhèn)溆玫木铙w前囊膜組織，充分研磨后加入細胞裂解液，抽取蛋白。加熱使蛋白變形，取2 μL蛋白樣品加入硝酸纖維素膜上，晾干后加入濃度為5%的胎牛血清封閉20 min。加入一抗(稀釋比例1∶200)，常溫下孵育30 min；加入PBS漂洗3次，加入二抗(稀釋比例1∶500)，常溫下孵育30 min。加入ECL化學(xué)發(fā)光，孵育1 min，X線膠片下曝光、顯影、定影。采用ImagePro軟件定量分析條帶灰度值。每個樣本重復(fù)實驗2～3次，取平均值。

1.3 晶狀體前囊膜組織TGF-β各亞型mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。取1.2中部分保存?zhèn)溆玫木铙w前囊膜組織，充分研磨后采用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TGF-β1上游引物：5′-AGCGACTCGCCAGAGTGGTTA-3′，下游引物：5′-GCAGTGTGTTATCCCTGCTGTCA-3′，引物長度293 bp；TGF-β2上游引物：5′-ACGGGGCGGGGCGGTGGA-3′，下游引物：5′-ACGGGGCGGGGCGGTGGA-3′，引物長度124 bp；TGF-β3上游引物：5′-GGGCTCATCGGAGTAACTTTCC-3′，下游引物：5′-TCTCTCGGTCATTCCCTTGG-3′，引物長度261 bp；內(nèi)參β-action上游引物：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，引物長度118 bp。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3mRNA相對表達量。

1.4 血清AGEs檢測 采用ELISA法。兩組入院第2天均留取空腹肘靜脈血3 mL，離心后分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測血清AGEs水平，嚴格按照AGEs試劑盒使用說明書操作。試劑盒購自北京方程生物科技有限公司。

1.5 觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β表達與血清AGEs水平關(guān)系的分析 采用Pearson相關(guān)分析法分析觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達及其各亞型mRNA表達與血清AGEs水平的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達及血清AGEs水平比較 觀察組與對照組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白相對表達量分別為45 863.58±231.08、32 314.88±158.42，血清AGEs水平分別為(17.26±2.32)、(11.15±1.95)μg/L；兩組比較P均<0.01。

2.2 兩組晶狀體前囊膜組織TGF-β各亞型mRNA相對表達量比較 觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β1mRNA相對表達量高于對照組，TGF-β2mRNA相對表達量低于對照組(P均<0.05)；兩組晶狀體前囊膜組織TGF-β3mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組晶狀體前囊膜組織TGF-β各亞型mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β表達與血清AGEs水平的關(guān)系 觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達、TGF-β1mRNA相對表達量與血清AGEs水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.86、0.93，P均<0.01)，晶狀體前囊膜組織TGF-β2mRNA相對表達量與血清AGEs水平呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.84，P<0.01)，晶狀體前囊膜組織TGF-β3mRNA相對表達量與血清AGEs水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

糖尿病患者發(fā)生白內(nèi)障的相關(guān)因子及調(diào)控機制仍不清楚。TGF-β是一種分泌型多肽信號分子，具有促進細胞外基質(zhì)合成和組織修復(fù)、調(diào)節(jié)細胞增殖和分化等作用[5]。TGF-β有三種不同的亞型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1在細胞或組織中的含量最為豐富，主要與慢性炎癥或纖維化相關(guān)。TGF-β2可表達于內(nèi)皮細胞及神經(jīng)細胞中，在上皮細胞的分化及成熟中發(fā)揮作用；TGF-β2可調(diào)控細胞外基質(zhì)合成，抑制晶狀體上皮細胞的增殖，對于維持眼的正常生理功能具有重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)可產(chǎn)生TGF-β3，并且TGF-β3在間質(zhì)細胞中亦有表達[6～9]。研究顯示，TGF-β在糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障的過程中發(fā)揮重要作用，TGF-β過度表達可能參與了糖尿病患者前囊膜下白內(nèi)障的發(fā)生[10]。亦有研究顯示，TGF-β細胞因子能通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而參與白內(nèi)障發(fā)生[11]。此外，TGF-β還可能通過增強纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、平滑肌肌動蛋白mRNA表達而發(fā)揮作用[12,13]。本研究結(jié)果顯示，觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達明顯高于對照組，提示晶狀體前囊膜上皮細胞TGF-β表達升高在糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障的過程中發(fā)揮重要作用。本研究兩組各亞型mRNA表達均出現(xiàn)差異性，觀察組晶狀體前囊膜組織TGF-β1mRNA相對表達量高于對照組，TGF-β2mRNA相對表達量低于對照組，兩組TGF-β3mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TGF-β1表達升高提示患者纖維化或炎癥水平較為明顯，TGF-β2表達降低提示患者晶狀體上皮細胞增殖較為明顯，說明TGF-β1、TGF-β2介導(dǎo)的纖維化或炎癥水平加重及晶狀體上皮細胞增殖共同參與了糖尿病并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)病過程。

AGEs是由還原糖在無酶催化下與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等反應(yīng)生成的大分子物質(zhì)，易積聚于各個組織、器官間隙[14]。AGEs在正常機體內(nèi)的形成過程很緩慢，與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、組織結(jié)構(gòu)、細胞氧化應(yīng)激及炎癥等均有關(guān)。研究表明，長期高血糖狀態(tài)可以增強非酶糖基化作用，加速AGEs在晶狀體的形成和積累，己形成的AGEs可能通過修飾蛋白質(zhì)等直接作用或發(fā)生配體-受體作用啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而參與糖尿病并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展[15～18]。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清AGEs水平明顯高于對照組，說明血清AGEs水平升高可能與糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障有關(guān)；觀察組血清AGEs水平與晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達、TGF-β1mRNA相對表達量呈正相關(guān)關(guān)系，與TGF-β2mRNA相對表達量呈負相關(guān)關(guān)系，與TGF-β3mRNA相對表達量無明顯相關(guān)性，表明TGF-β與AGEs尤其是TGF-β1、TGF-β2亞型相互作用，二者可能共同參與了糖尿病并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展，也說明AGEs與TGF-β1、TGF-β2介導(dǎo)的纖維化或炎癥水平加重及晶狀體上皮細胞增殖共同參與了糖尿病患者并發(fā)白內(nèi)障的發(fā)病過程。AGEs與TGF-β1、TGF-β2之間的相互作用及調(diào)控機制仍有待進一步細胞實驗進行驗證。

綜上所述，糖尿病并發(fā)白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織TGF-β蛋白表達、TGF-β1mRNA表達及血清AGEs水平均升高，晶狀體前囊膜組織TGF-β2mRNA表達降低；TGF-β1、TGF-β2與AGEs可能共同參與了糖尿病患者白內(nèi)障的發(fā)生過程。