宮錦蕾，王美鳳，邢國英，孫英華，夏海，王復(fù)超，張兆卿

(1濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院，山東濰坊262500；2大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

骨肉瘤是一種高度惡性的原發(fā)性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，早期易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，5年生存率低[1,2]。15%～20 %的骨肉瘤患者在初診時(shí)影像學(xué)已發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，約50 %的骨肉瘤患者在晚期治療期間發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，最終發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的患者可高達(dá)80%[3]。近年來骨肉瘤在病因、發(fā)生發(fā)展機(jī)制、早期診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的基因尚不明確，臨床上也缺乏有效的靶向治療藥物及分子生物學(xué)標(biāo)志物。微小核糖核酸(miRNA)是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，參與調(diào)控眾多關(guān)鍵的細(xì)胞通路及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[4,5]。但目前有關(guān)miR-495在骨肉瘤中的作用研究甚少,為此，我們進(jìn)行了如下研究。

1 臨床資料

選擇2012年2月～2013年1月在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院行手術(shù)治療的骨肉瘤患者56例，男34例、女22例，年齡>20歲16例、≤20歲40例，腫瘤部位在四肢49例、其他7例。排除合并嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能不全及其他腫瘤患者?；颊咝g(shù)前均未行放化療及生物免疫治療。56例均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為骨肉瘤，腫瘤直徑>5 cm 40例、≤5 cm 16例，Enneking分期Ⅰ～Ⅱa期14例、Ⅱb～Ⅲ期42例，淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移18例、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移38例。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

2 方法與結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織及其癌旁組織miR-495表達(dá)檢測 收集患者術(shù)中切除的骨肉瘤組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5 cm，病理檢查證實(shí)為正常組織)標(biāo)本各56例份，取材后迅速置入液氮中，-70 ℃保存，采用real-time PCR法檢測miR-495表達(dá)。具體方法：取液氮中保存的骨肉瘤組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，研磨后采用TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取組織總RNA，分光光度儀檢測總RNA的純度及濃度，以O(shè)D260/OD280為1.9～2.0作為合格標(biāo)準(zhǔn)。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明書配置real-time PCR體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-495引物序列：上游引物為5′-TCCGATTCTTCACGTGGTAC-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內(nèi)參U6引物序列：上游引物為5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-495相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，骨肉瘤組織及其癌旁組織miR-495相對(duì)表達(dá)量分別為0.42±0.16、1.01±0.05，兩者比較P<0.01。骨肉瘤組織miR-495相對(duì)表達(dá)量的均值為0.42。56例患者中，miR-495相對(duì)表達(dá)量≤0.42者31例、>0.42者25例。

2.2 骨肉瘤組織miR-495表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系 收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、Enneking分期、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，采用門診或者住院復(fù)查及電話隨訪的方式進(jìn)行，以手術(shù)出院當(dāng)日作為隨訪起點(diǎn)?？偵嫫诙x為從隨訪起點(diǎn)開始到死亡日期或最終觀察日期2018年1月，失訪及其他原因?qū)е碌乃劳霭唇匚矓?shù)據(jù)處理，計(jì)算5年生存率。分析miR-495表達(dá)≤均值與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

結(jié)果顯示，骨肉瘤組織miR-495表達(dá)≤0.42與患者Enneking分期、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.01)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤部位均無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 骨肉瘤組織miR-495表達(dá)≤0.42與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

骨肉瘤組織miR-495表達(dá)≤0.42者5年生存率為26%，>0.42者5年生存率為48%；二者比較P<0.01。見圖1。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果顯示，miR-495表達(dá)≤0.42是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=3.699，95%CI：1.985～6.941，P<0.05)。

圖1 miR-495表達(dá)與骨肉瘤患者生存期的關(guān)系

3 討論

病理學(xué)分期是預(yù)測骨肉瘤生物學(xué)行為及患者預(yù)后的傳統(tǒng)手段，但其存在明顯的局限性。目前臨床急需尋找有效而準(zhǔn)確的早期診斷及判斷預(yù)后的骨肉瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物。研究證實(shí)，基因表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]，異常表達(dá)的基因有可能成為惡性腫瘤有效而準(zhǔn)確的分子生物學(xué)標(biāo)志物[7,8]。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為20～25個(gè)核苷酸非編碼小分子RNA，雖然miRNA僅占人體基因總數(shù)的2%，但卻參與調(diào)控人體30%以上的基因表達(dá)[9,10]。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等惡性生物學(xué)行為，從而參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[11]。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a、miR-143、miR-145、miR-200b在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)均降低，并與骨肉瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)。Wang等[13]報(bào)道，與正常骨組織比較，骨肉瘤組織中miR-214表達(dá)明顯增高，并且高表達(dá)的miR-214與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及化療耐藥有關(guān)。miR-495是近期發(fā)現(xiàn)的miRNA家族重要成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，miR-495在食管癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低[14～16]，而在肝細(xì)胞癌、乳腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高[17,18]，提示miR-495存在組織和細(xì)胞的特異性，在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同作用。

目前有關(guān)miR-495在骨肉瘤組織中表達(dá)變化的研究甚少。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織miR-495相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，提示miR-495表達(dá)異常下調(diào)可能參與了骨肉瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織miR-495相對(duì)表達(dá)量≤0.42與患者Enneking分期、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑及腫瘤部位均無關(guān)；說明miR-495異常低表達(dá)可能參與了骨肉瘤的轉(zhuǎn)移過程。miRNA的功能主要取決于其下游靶基因的生物學(xué)效應(yīng)，目前miR-495調(diào)控骨肉瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移的具體下游分子機(jī)制尚不完全清楚。Zhang等[19]研究證實(shí)，miR-495通過負(fù)調(diào)控下游靶基因MYB表達(dá)而抑制膠質(zhì)瘤瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-495通過靶向調(diào)控MTA3基因而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。但miR-495在骨肉瘤中的下游調(diào)控靶基因尚有待進(jìn)一步探討。

目前有關(guān)miR-495對(duì)惡性腫瘤患者預(yù)后影響的研究較少。Wang等[21]在對(duì)62例髓母細(xì)胞瘤患者的隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，miR-495低表達(dá)與髓母細(xì)胞瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-495表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)[22]。目前尚未見miR-495對(duì)骨肉瘤患者預(yù)后影響的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織miR-495表達(dá)≤0.42者5年生存率低于miR-495表達(dá)>0.42者，miR-495表達(dá)≤0.42是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；說明骨肉瘤組織miR-495表達(dá)≤0.42提示患者預(yù)后較差。

綜上所述，骨肉瘤組織中miR-495表達(dá)降低，miR-495異常低表達(dá)可能參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，并且與患者預(yù)后不良有關(guān)。miR-495有望成為骨肉瘤早期診斷及判斷預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志物，但其在骨肉瘤中的具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。