欒雅靜，許海委，徐寶山，楊強(qiáng)

(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070；2天津市天津醫(yī)院)

椎間盤退變是下腰痛發(fā)病的最主要原因，利用組織工程學(xué)方法修復(fù)退變的椎間盤組織，以恢復(fù)椎間盤結(jié)構(gòu)和功能，逐漸成為臨床治療下腰痛的研究重點(diǎn)[1]。目前用于構(gòu)建組織工程椎間盤的種子細(xì)胞包括椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞、髓核細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等[2,3]，但均存在取材困難、對(duì)機(jī)體損傷較大及來源有限等問題。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(以下簡稱臍帶干細(xì)胞)是存在于臍帶組織的一種新型間充質(zhì)干細(xì)胞，其不但具有間充質(zhì)干細(xì)胞的典型特征，還具有與胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞相似的高度體外富集和擴(kuò)增特點(diǎn)；且來源廣泛、易于獲取、保存方便、無倫理學(xué)爭議、無免疫排斥反應(yīng)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，臍帶干細(xì)胞能在體外誘導(dǎo)分化為髓核細(xì)胞[5]，但目前鮮有關(guān)于體外誘導(dǎo)臍帶干細(xì)胞向纖維環(huán)細(xì)胞分化的研究。2016年1月～2018年1月，本研究采用體外共培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)臍帶干細(xì)胞向纖維環(huán)細(xì)胞分化，現(xiàn)分析結(jié)果并探討達(dá)到最佳誘導(dǎo)效果時(shí)二者的比例。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇天津市天津醫(yī)院婦產(chǎn)科出生的健康足月順產(chǎn)胎兒的臍帶約30 cm，本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，胎兒父母均知情同意。選擇新西蘭大白兔2只，3～4 月齡，雌雄不限，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，來源于天津市天津醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑：人Ⅰ型膠原α2、人Ⅱ型膠原α1、人蛋白多糖AGC ELISA試劑盒均購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司， Anti-Collagen Ⅰ antibody ab34710、Anti-Collagen Ⅱ antibody ab34712均購于美國Abcam公司，SYBR Premix Ex Taq試劑盒購于日本TaKaRa公司。主要儀器：iQ5 real-time PCR擴(kuò)增儀購于美國Applied Biosystems公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購于美國Thermo Forma公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，5415D型離心機(jī)購于德國Eppendorf公司。

1.2 人臍帶干細(xì)胞分離和培養(yǎng) 取臍帶組織，放入無菌D-Hank′s液中洗去殘留血液。將臍帶剪成4 cm大小節(jié)段，縱行剪開臍帶外膜，剝離血管。取血管之間以及血管與外膜之間的華通膠組織，D-Hank′s液沖洗后，剪切成約1 mm3大小碎塊，浸于0.075% Ⅱ型膠原酶溶液中，37 ℃恒溫消化18 h，2 500 r/min離心10 min后棄上清。剩余液體用0.25%胰蛋白酶于37 ℃條件下恒溫消化30 min，2 500 r/min離心10 min后棄上清。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。半量換液除去未貼壁細(xì)胞，每3天換液1次。

1.3 兔纖維環(huán)細(xì)胞分離和培養(yǎng) 將2只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射空氣處死，無菌條件下取出胸、腰段脊柱。去除軟骨終板及周圍肌肉、韌帶組織，分離椎間盤組織，用D-Hank′s 液漂洗2遍后分離纖維環(huán)組織。用剪刀將纖維環(huán)組織剪碎成乳糜狀，經(jīng)0.25%胰蛋白酶預(yù)消化2 h。加入血清終止胰酶消化，1 000 r/min離心10 min后棄上清。加入0.2 % Ⅱ型膠原酶重懸細(xì)胞及組織塊，組織塊完全消化后過濾，1 000 r/min離心10 min收集沉淀細(xì)胞。用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。

1.4 人臍帶干細(xì)胞與兔纖維環(huán)細(xì)胞共培養(yǎng) 取第二代臍帶干細(xì)胞消化后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL。取第二代兔纖維環(huán)細(xì)胞消化后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度分別為1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL。將臍帶干細(xì)胞隨機(jī)分為0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組，各組均取2×104/mL濃度臍帶干細(xì)胞單細(xì)胞懸液1 mL接種于Transwell 6孔板下層；1∶2組、1∶1組、2∶1組分別取細(xì)胞密度為1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL的兔纖維環(huán)細(xì)胞單細(xì)胞懸液1 mL接種于Transwell 6孔板上層，使纖維環(huán)細(xì)胞與臍帶干細(xì)胞的比例分別為1∶2、1∶1、2∶1。加入培養(yǎng)液，通過0.4 μm的微孔濾膜相通形成共培養(yǎng)，培養(yǎng)14天。

1.5 臍帶干細(xì)胞向纖維環(huán)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)效果觀察

1.5.1 各組臍帶干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 培養(yǎng)14天，收集各組臍帶干細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察臍帶干細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5.2 各組臍帶干細(xì)胞中纖維環(huán)細(xì)胞相關(guān)基因Ⅰ型膠原、蛋白聚糖mRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。培養(yǎng)14天，收集各組臍帶干細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書檢測Ⅰ型膠原、蛋白聚糖mRNA相對(duì)表達(dá)量。Ⅰ型膠原上游引物：5′-TGCTCGTGGAAATGATGGTG-3′，下游引物：5′-CCTCGCTTTCCTTCCTCTCC-3′，引物長度450 bp。蛋白聚糖上游引物: 5′-AAGGGCGAGTGGAATGATGT-3′，下游引物：5′-CGTTTGTAGGTGGTGGCTGTG-3′，引物長度100 bp。內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物： 5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3 ′，引物長度501 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔC法計(jì)算Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3 各組臍帶干細(xì)胞中纖維環(huán)細(xì)胞相關(guān)基因Ⅰ型膠原、蛋白聚糖蛋白表達(dá)檢測 ①采用ELISA法。培養(yǎng)14天，收集各組臍帶干細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS沖洗5 min×3次。每1×106個(gè)細(xì)胞中加入200 μL PBS，重懸并反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎，1 500 r/min離心10 min，取上清液。采用ELISA法檢測Ⅰ型膠原、蛋白聚糖表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。②采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法。培養(yǎng)14天，取各組臍帶干細(xì)胞爬片后PBS沖洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶室溫10 min；PBS沖洗5 min×3次；0.25%Triton X-100室溫孵育標(biāo)本10 min，沖洗5 min×3次；加入10%羊血清室溫條件下封閉30 min，甩去血清。加入Anti-Collagen Ⅰ antibody ab34710(稀釋比例為1∶300)，4 ℃孵育過夜；加入羊抗兔二抗(稀釋比例為1∶300)，室溫條件下孵育1 h。PBS沖洗5 min×3次，加入SABC復(fù)合物，室溫下作用30 min～1 h。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明20 min，中性樹膠封固。200倍光鏡下采用半定量積分法判定結(jié)果，即根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞比例及著色程度進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，10%～30%為2分，>30%為3分；著色程度評(píng)分：未著色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘，0為陰性，1～2為弱陽性，3～4為陽性，4以上為強(qiáng)陽性。

2 結(jié)果

2.1 各組臍帶干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化比較 0∶1組臍帶干細(xì)胞多呈長梭形。1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?，?xì)胞出現(xiàn)多個(gè)突起，局部區(qū)域相鄰細(xì)胞突起連成網(wǎng)狀；隨著纖維環(huán)細(xì)胞的比例升高，臍帶干細(xì)胞上述變化越明顯，越接近纖維環(huán)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，2∶1組纖維環(huán)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征最明顯。

2.2 各組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對(duì)表達(dá)量均依次升高，兩組間比較P均<0.01。見表1。

表1 各組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與0:1組比較，aP<0.01；與1∶2組比較，bP<0.01；與1∶1組比較，cP<0.01。

2.3 各組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖蛋白表達(dá)比較 0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖表達(dá)均依次升高，兩組間比較P<0.05或<0.01。見表2。0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)分別呈陰性、弱陽性、陽性及強(qiáng)陽性。

表2 各組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖蛋白表達(dá)比較

注：與0∶1組比較，aP<0.01；與1∶2組比較，bP<0.05，cP<0.01；與1∶1組比較，dP<0.01。

3 討論

研究證實(shí)，臍帶干細(xì)胞是一種多潛能成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能。臍帶干細(xì)胞可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、胰島細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等[6～8]；經(jīng)體外誘導(dǎo)后可分化為椎間盤樣細(xì)胞[9]，且間充質(zhì)干細(xì)胞和椎間盤細(xì)胞共培養(yǎng)后能明顯促進(jìn)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)合成[10]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)纖維環(huán)細(xì)胞與臍帶干細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，臍帶干細(xì)胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切危㈤_始出現(xiàn)細(xì)胞突起，出現(xiàn)纖維環(huán)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步證實(shí)二者共培養(yǎng)可誘導(dǎo)臍帶干細(xì)胞向纖維環(huán)細(xì)胞分化。

目前關(guān)于纖維環(huán)細(xì)胞通過共培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)臍帶干細(xì)胞分化的最適誘導(dǎo)濃度尚不明確，以往的研究多采用1∶1的細(xì)胞比例。張燕等[11]報(bào)道，采用細(xì)胞比例為1∶1的共培養(yǎng)體系能誘導(dǎo)臍帶干細(xì)胞向NP細(xì)胞分化。張明等[12]報(bào)道，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與纖維環(huán)細(xì)胞按1∶1比例共培養(yǎng)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向纖維環(huán)細(xì)胞分化的可能。本研究將纖維環(huán)細(xì)胞與臍帶干細(xì)胞按照不同比例進(jìn)行共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示，纖維環(huán)細(xì)胞與臍帶干細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，纖維環(huán)細(xì)胞的比例越高，臍帶干細(xì)胞出現(xiàn)的纖維環(huán)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征越明顯；當(dāng)二者比例為2∶1時(shí)誘導(dǎo)效果最佳。Ⅰ型膠原和蛋白聚糖是纖維環(huán)細(xì)胞的主要成分，目前均為作為纖維環(huán)細(xì)胞的標(biāo)記物。Ⅰ型膠原和蛋白聚糖是關(guān)節(jié)盤行使功能的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分，且蛋白聚糖在關(guān)節(jié)盤中間帶承受壓縮力過程中起重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原和蛋白聚糖基因在纖維環(huán)細(xì)胞中呈高表達(dá)，而在臍帶干細(xì)胞中呈低表達(dá)，故誘導(dǎo)后臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖基因表達(dá)在一定程度上可反映臍帶干細(xì)胞向纖維環(huán)細(xì)胞分化的程度。本研究結(jié)果顯示，0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、蛋白聚糖 mRNA相對(duì)表達(dá)量及Ⅰ型膠原、蛋白聚糖蛋白表達(dá)均依次升高，兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明纖維環(huán)細(xì)胞與臍帶干細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)臍帶干細(xì)胞表達(dá)纖維環(huán)細(xì)胞相關(guān)基因，并分泌纖維環(huán)細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞基質(zhì)，且纖維環(huán)細(xì)胞與臍帶干細(xì)胞比例為2∶1時(shí)效果最明顯。

纖維環(huán)細(xì)胞成分主要以Ⅰ型膠原蛋白為主，而髓核細(xì)胞則以Ⅱ型膠原蛋白為主。Ⅰ型膠原蛋白使纖維環(huán)細(xì)胞具有較好的張力，有助于維持細(xì)胞形態(tài)，更好地承受來自脊柱不同方向的牽引力。本研究結(jié)果顯示，0∶1組、1∶2組、1∶1組、2∶1組臍帶干細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)分別呈陰性、弱陽性、陽性及強(qiáng)陽性；提示臍帶干細(xì)胞與纖維環(huán)細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)臍帶干細(xì)胞分化為纖維環(huán)細(xì)胞，并使其具備合成Ⅰ型膠原蛋白的能力，且纖維環(huán)細(xì)胞與臍帶干細(xì)胞比例為2∶1時(shí)的效果最明顯。

綜上所述，纖維環(huán)細(xì)胞與臍帶干細(xì)胞共培養(yǎng)能誘導(dǎo)臍帶干細(xì)胞向纖維環(huán)細(xì)胞分化，二者共培養(yǎng)的最佳比例為2∶1。