(上海市兒童醫(yī)院心內科，上海交通大學附屬兒童醫(yī)院心內科，上海 200062)

肥厚型心肌病(HCM)是一類以左心室肥厚尤其是非對稱性室間隔肥厚為特征的心肌病，該病病人年死亡率約為1%[1]，是最常見的單基因遺傳心血管疾病，主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，是青少年和運動員猝死的首要原因[2-3]。HCM分為肥厚型梗阻性心肌病和肥厚型非梗阻性心肌病。HCM在成人的患病率為0.02%～0.23%[4]，我國成年人群發(fā)病率約為0.08%[2]。HCM占兒科原發(fā)性心肌病的20%～30%，兒童HCM可以累及右心室或者雙側心室，伴有明顯的右室流出道梗阻，特別是嬰兒病例[5-6]。目前，兒童HCM的發(fā)病率暫無統(tǒng)計數(shù)據(jù)，雖然HCM總的發(fā)病率較低，但結合我國龐大的人口基數(shù)及其死亡率，推測兒童HCM發(fā)病率不容樂觀。近5年來，我院每年收治的HCM患兒均超過了100例，因此較早地精準診斷該病的致病原因，顯得頗為重要[7]。據(jù)統(tǒng)計，40.0%～74.2%的HCM病因并不明確，其中小于1歲的嬰兒約占35.8%，而在明確病因的HCM中，以遺傳因素為主，包括家族性/肌節(jié)蛋白基因缺陷、先天性代謝缺陷等[8]。兒童常見非肌小節(jié)HCM包括代謝缺陷、畸形綜合征和神經肌肉疾病[9]；成人常見非肌小節(jié)HCM包括代謝蓄積病，如DANON病(LAMP2基因)，F(xiàn)ABRY病(GLA基因)、左室肥厚伴WPW綜合征(PRKAG2基因)、家族性淀粉樣變性(TTR基因)和線粒體心肌病[10]。針對致病基因進行篩查，明確致病突變，有助于HCM病人的診斷和家系成員的早期診斷和排查。最新ACCF/AHA的HCM診治指南推薦對HCM病人進行全面的致病基因檢測[9]。但是由于HCM致病基因多，Sanger測序等傳統(tǒng)的篩查方法耗時長、費用昂貴，難以用于快速全面篩查。另外，由于發(fā)現(xiàn)的HCM致病突變非常多，遺傳異質性導致了目前仍難以明確基因型與表型的關聯(lián)，限制了基因篩查在判斷HCM預后以及危險分層中的應用[11]。因此本研究利用全外顯子測序(WES)，對一個漢族HCM家系進行全面的致病基因檢測，評估WES應用于HCM遺傳檢測的可行性，并對發(fā)現(xiàn)的致病基因突變與其表型的相關性進行分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究對象為一安徽籍家系(圖1)。先證者是一位12歲男性患兒(Ⅲ-1)。因體檢發(fā)現(xiàn)“心動過緩”及心臟雜音來本院就診，初步診斷為HCM；實驗室檢查示N末端腦鈉肽為933.53 ng/L，既往無高血壓、冠心病及糖尿病病史，患兒接受了相關藥物治療。

1.2 研究方法

收集該家系所有成員詳細的臨床資料，包括體格檢查、發(fā)病年齡、心電圖及超聲心動圖結果，并根據(jù)需要行動態(tài)心電圖檢查。本研究獲上海市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(倫理號為：2017R047-E02)，所有研究對象簽署知情同意書。

1.3 全外顯子組測序

采集所有研究對象的外周血2 mL，抽提血液基因組DNA，使用Roche Nimblegen SeqCap EZ Exome V3(羅氏)試劑盒，對患兒樣本基因外顯子編碼區(qū)及其上下游20 bp區(qū)域進行捕獲并擴增，建庫，后采用Hiseq 2500高通量測序平臺測序，每個樣品產生15 bp的配對末端測序數(shù)據(jù)，樣本測序深度平均為100X，核心目標序列區(qū)域的測序深度不低于20X。

1.4 生物信息學分析

對測序結果進行圖像識別(Base calling)，統(tǒng)計測序的Reads長度、數(shù)量及數(shù)據(jù)產量。然后比對參考基因組，獲得比對到基因組上的Uniquemapped reads，并對數(shù)據(jù)進行質控、SNP檢測、InDel檢測及注釋。測序完成后，利用自主開發(fā)的軟件分析過濾數(shù)據(jù)，使用BWA-0.7.10軟件與人類基因組數(shù)據(jù)庫(GRCh 37 /hg 19)進行比對；再使用GATK軟件，識別并過濾單堿基變異和插入缺失變異；利用數(shù)據(jù)庫如千人基因組、ExAC、 gnomAD、HGMD、 ClinVar、 OMIM及本院的370例樣本的全外顯子測序數(shù)據(jù)庫等進行注釋。然后使用SIFT、 Polyphen2、 MutationTaster、MutationAssessor以及HSF等軟件對候選基因的致病性進行預測。登錄https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene對突變位點進行氨基酸序列同源性比對。根據(jù)數(shù)據(jù)庫注釋結果、軟件預測結果及其臨床表型，對致病突變位點進行篩選過濾。得到候選基因突變列表(Candidates.xlsx)，利用ANNOVAR軟件預測候選基因突變，并利用GERP 評分表對候選基因的致病性進行排名。對檢測到的基因突變，按照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會遺傳變異分類標準的指南解釋[12]。

對遺傳變異進一步采用如下步驟進行篩選：優(yōu)先關注公共數(shù)據(jù)庫中收錄的可能與疾病相關的遺傳變異，如小的插入/缺失(INDEL)、典型的剪切位點改變及錯義變異；根據(jù)正常人數(shù)據(jù)庫過濾大于5%的SNP突變(已知的 MAF≥5%的致病性變異除外)；篩選過濾掉無義突變、移碼突變、可變剪切及錯義突變等因素；再次與HGMD、ClinVar數(shù)據(jù)庫收錄的遺傳變異進行比對；根據(jù)保守性和軟件預測有害性的結果，進行過濾篩選；最后根據(jù)臨床表型，進一步篩選過濾致病基因突變。

1.5 Sanger測序

對患兒和其父母相關突變所在區(qū)域進行PCR擴增，PCR產物送蘇州泓迅生物科技有限公司進行一代測序，進一步驗證基因突變情況。具體步驟為：從NCBI網站下載MYH7基因DNA全序列(NM_000257.3，Genebank ID:4625)；采用Primer 5軟件設計聚合酶鏈式反應引物，由上海生工生物工程有限公司合成；利用PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)進行擴增。引物序列：F:5′-CCAGCAGTC-ATCTCTTTACCAA-3′；R:5′-CCCAGTGGCAT-ATATCACCT-3′。反應條件：95 ℃預變性5 min；然后以94 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。膠回收、純化，采用正向測序，分析基因序列，然后與標準序列進行比對分析。

2 結 果

2.1 先證者臨床表型

先證者(Ⅲ-1)為男性(圖1)，12歲。心電圖提示竇性心動過緩、異常Q波、ST改變(Ⅱ、V5、V6、V7導聯(lián)ST壓低0.5～1.2 mm)、T波改變(各導聯(lián)T波低鈍、倒置)；超聲心動圖檢查提示心房增大，左心室舒張末期內徑為4.2 cm，左心室收縮末內徑為2.6 cm，左心室射血分數(shù)為69%，左心室縮短分數(shù)為39%。左心室流出道流速快(2.4 m/s)，二尖瓣中度反流，三尖瓣前葉脫垂伴輕中度反流(反流壓差為38 kPa)。

2.2 致病基因檢測

通過WES總共篩查出5個致病基因，分別為MYH7(NM_000257.3)、AGL (NM_000028)、KCNV2 (NM_133497)、ILDR1 (NM_001199799)以及RDX (NM_002906)。見表1。查閱OMIM數(shù)據(jù)庫，根據(jù)數(shù)據(jù)庫和臨床表型分析，僅MYH7基因突變與臨床表型有關聯(lián)。WES測序發(fā)現(xiàn)先證者攜帶MYH7基因雜合突變c.1210G>A，進一步通過Sanger測序證實其突變(圖2)，家系遺傳篩查，先證者父親和母親均無突變。詢問家族史，患兒的伯父心源性猝死，未采集到相關血液樣本等，故無法推測是否由于家族性HCM誘導的心源性猝死。該突變導致纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔珻lustal X分析MYH7基因404 位氨基酸殘基的保守性發(fā)現(xiàn)，其在不同物種之間具有高度保守性(圖3)。

“□”代表正常男性，“○”代表正常女性；Ⅱ-2為患兒伯父，已去世；Ⅲ-1為患兒。

圖1HCM家系圖

紅、綠、藍、黑四色波峰分別代表胸腺嘧啶脫氧核苷酸、腺嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸。箭頭所指即為突變位點，綠色主峰下出現(xiàn)黑色套峰，表明發(fā)生雜合突變。

圖2HCM患兒及其家系Sanger測序圖

人：NP_000248.2，類人猿：XP_001150786.3，家犬：NP_001107183.1，牛：NP_777152.1，鼠：NP_542766.1，大鼠：NP_058936.1，雞：NP_001001302.1，斑馬魚：NP_001106204.1。

圖3 突變位點在不同物種氨基酸同源序列比對結果

3 討 論

HCM是主要由編碼肌小節(jié)蛋白的基因突變所導致的常染色體顯性遺傳病，其中MYH7基因是HCM的主要致病基因之一，占所有遺傳篩查陽性病人的35%～40%[13-14]，明確MYH7基因突變所致HCM的臨床特點，對于精準判斷此類病人的預后并進行危險分層具有重要意義。在本研究中，通過對1個漢族HCM家系進行全面的致病基因篩查，通過生物信息學分析、數(shù)據(jù)庫注釋、軟件預測和臨床表型分析，發(fā)現(xiàn)患兒的表型可能由MYH7基因的V404M突變所致，該突變具有較嚴重的致病性。本研究進一步證實，MYH7基因的V404M突變?yōu)橛泻ν蛔?，可能為HCM的致病基因。

HCM是常染色體顯性遺傳病，較常見的心血管疾病。HCM相關的粗肌絲相關基因MYH7的突變，影響肌纖維產生張力，心肌代償性增生及肥厚[15]，因此，特異性的心肌球蛋白抑制劑可能是此類基因突變疾病的潛在治療方法[16-18]。β受體阻滯劑可以減輕左心室流出道梗阻的癥狀。應根據(jù)心率、血壓、流出道壓力階差水平等調整β受體阻滯劑的使用量，并逐漸增加至最大耐受量，并堅持長期甚至終生服藥，避免突然停藥[19]。本例患兒給予螺內酯、卡托普利減輕心臟負荷治療，給予倍他樂克改善心功能，經過精準診治，患兒情況可，無特殊不適，無胸悶胸痛等。

隨著二代測序技術的出現(xiàn)，特別是WES等二代測序能快速準確地了解基因序列信息，可以快速精準地幫助我們了解遺傳性疾病，通過對家族相關基因的比對分析，能夠較準確地發(fā)現(xiàn)致病基因及突變[20]。本研究通過外顯子捕獲技術富集全基因組DNA，同時應用SIFT、PolyPhen2、HSF軟件，預測基因突變的致病性，分析臨床表型的同時，能夠較準確地找出相關的致病基因。本研究全外顯子測序發(fā)現(xiàn)了與心肌病緊密相關的MYH7基因突變。本研究通過WES發(fā)現(xiàn)了先證者攜帶的MYH7基因雜合c.1210G>A，進一步通過Sanger測序證實了其突變，家系遺傳篩查先證者父親和母親均無突變，提示HCM不僅僅是由遺傳因素決定，后天的環(huán)境因素也可能參與HCM致病調控。該突變導致纈氨酸變?yōu)榧琢虬彼?，ClustalX分析MYH7基因404位氨基酸殘基的保守性發(fā)現(xiàn)，其在不同物種之間具有高度保守性，若該位置發(fā)生突變，很可能會影響基因和蛋白質的功能。VAN DRIEST等[21]研究顯示，綜合分析389個HCM病人的基因突變，分析MYH7基因雜合c.1210G>A突變，導致纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔菦]有詳細指出該突變的致病性等。

精準醫(yī)學研究前景廣闊，其在心血管領域大有可為[22]。通過WES測序，本研究發(fā)現(xiàn)了該家系中MYH7基因的突變位點，并通過各種預測軟件如SIFT、Polyphen2、MutationTaster等，預測該突變?yōu)橹虏⊥蛔?，并且該突變與疾病表型一致，攜帶該基因突變的病人應考慮安裝植入性除顫器，預防猝死。其次，對HCM病人進行致病基因檢測，明確疾病的遺傳因素，對于家系成員的早期診斷具有重要意義，有助于突變攜帶者的針對性早期干預和治療。因此，對于家系中的攜帶者，可以告知其本人及家屬潛在的風險，注重預防并定期隨訪，以針對心功能出現(xiàn)的異常情況及時給予干預。