，，5

(1 西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(西安市兒童醫(yī)院)心內(nèi)科，陜西 西安 710003； 2 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；3 西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(西安市兒童醫(yī)院)超聲科； 4 陜西省兒科疾病研究所； 5 西安市兒童健康與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

糖原貯積?、蛐?GSDⅡ)又稱龐貝病，發(fā)病率約為1/40 000[1]，是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病。其發(fā)病機(jī)制為位于17q25.3染色體上編碼酸性α-葡糖苷酶(GAA)的基因發(fā)生突變，使溶酶體內(nèi)GAA缺乏，致糖原不能轉(zhuǎn)化為葡萄糖，從而在骨骼肌、心肌和平滑肌等組織細(xì)胞內(nèi)大量沉積[2]。本研究對(duì)2016年12月—2017年5月于西安市兒童醫(yī)院心內(nèi)科確診的4例伴有肥厚型心肌病的GSDⅡ病兒的臨床特點(diǎn)、GAA活性以及GAA基因進(jìn)行分析，總結(jié)臨床表現(xiàn)、酶學(xué)特點(diǎn)和基因變異的相互關(guān)系，并對(duì)下一胎進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2016年12月—2017年5月西安市兒童醫(yī)院心內(nèi)科確診的GSDⅡ住院病兒4例,男3例,女1例，發(fā)病年齡為2～8月齡，確診年齡為2～9月。4例病兒均因呼吸道感染就診，有明顯的運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩或伴語(yǔ)言發(fā)育落后，主要為四肢無(wú)力、肌張力低下，累及四肢、軀干肌，面肌未受累。4例呼吸肌無(wú)力，均有心肌受累；舌體肥大2例；4例伴有肝大。4例肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)均升高，達(dá)正常值3～10倍。4例進(jìn)行了心電圖檢查，提示PR間期80～90 ms，雙心室肥厚。1例肌電圖檢查示肌源性損害。4例病兒心臟B超均示左心室增大，左心室壁彌散性增厚，左心室后壁內(nèi)膜增厚，提示肥厚型心肌病。病兒分別來(lái)自4個(gè)不同家庭，父母均非近親婚配，無(wú)遺傳病家族史，因呼吸道感染、心臟超聲發(fā)現(xiàn)心肌肥厚就診。臨床資料包括病史、心電圖、超聲心動(dòng)圖、心臟核磁共振、心肌酶、肝腎功及GAA酶活性檢查和基因檢測(cè)。本研究經(jīng)西安市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，病兒家長(zhǎng)均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1GAA酶活性測(cè)定 外周血白細(xì)胞用生理鹽水重懸，取20 μL白細(xì)胞懸液(約2 μg蛋白)加入80 μL反應(yīng)體系(1 mmol/L 4-甲基傘形酮-α-D-葡萄糖苷，pH 4.3的50 mmol/L醋酸鈉緩沖液，1 g/L的Triton X-100，10 μmol/L阿卡波糖)中，37 ℃水浴反應(yīng)2 h。加入pH 10.7的0.1 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液150 μL終止反應(yīng)。檢測(cè)反應(yīng)體系熒光(BioTek SynergyH4多功能酶標(biāo)儀)激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm?？瞻讓?duì)照為相同條件，反應(yīng)體系中不加蛋白。配置不同濃度的4-甲基傘形酮，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出產(chǎn)物濃度。蛋白濃度用Bradford法測(cè)定。

1.2.2基因組DNA的提取和GAA基因突變分析基因組DNA的提?。翰杉杭捌涓改竿庵苎? mL，用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA，放至-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。高通量測(cè)序(病兒2)：將先證者的基因組DNA送至北京信諾百世醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)基因panel的靶向捕獲二代測(cè)序，對(duì)二代測(cè)序所分析出的候選基因突變位點(diǎn)在家系內(nèi)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。Sanger測(cè)序(病兒1、3、4)：依據(jù)NCBI GAA基因 (NM_000152.3)序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增GAA基因的20個(gè)外顯子序列。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min， 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，之后采用ABI 3500dx儀器進(jìn)行雙向測(cè)序。產(chǎn)前基因篩查：針對(duì)家庭內(nèi)有明確基因診斷的病兒母親在孕7～12周采集絨毛膜，或者于孕16周后行羊膜穿刺，抽取羊水，提取基因組DNA。按照上述Sanger測(cè)序的方法，對(duì)相應(yīng)的突變位點(diǎn)所在的外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 GAA酶活性

病兒1、2和3 GAA的活性分別為2.5、2.1和1.9 nmol/(g·min)，病兒4未行GAA活性測(cè)定。見(jiàn)表1。

2.2 GAA基因突變分析

4例病兒均為復(fù)合雜合突變，分別來(lái)自于病兒父親和母親(見(jiàn)表1)。在檢測(cè)到的8個(gè)突變中有5個(gè)錯(cuò)義突變，3個(gè)插入突變，根據(jù)生物信息分析軟件SIFT、PolyPhen2及Mutation_Taster致病性分析以及美國(guó)ACMG指南[3]預(yù)測(cè)，其中7個(gè)突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?，病?攜帶的p.L701P突變預(yù)測(cè)為可疑致病，結(jié)合病兒GAA活性的檢測(cè)結(jié)果，確定為致病性的突變。而在已經(jīng)檢測(cè)出的突變位點(diǎn)中，p.L701P、p.W279C、p.N535Qfs*3突變位點(diǎn)在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)中均未見(jiàn)報(bào)道。4例病兒均攜帶復(fù)合雜合突變，符合常染色體隱性遺傳，突變測(cè)序峰圖見(jiàn)圖1。

2.3 治療、隨訪以及產(chǎn)前GAA基因突變檢測(cè)

1例病兒接受Myozyme GAA酶替代治療1個(gè)月，其余3 例病兒均未接受酶替代治療。4例病兒確診后2～6個(gè)月內(nèi)均死亡，死亡原因?yàn)榉尾扛腥?、肺不張合，?dǎo)致呼吸循環(huán)衰竭。2例病兒母親孕下一胎，于妊娠期行羊水穿刺胎兒GAA基因檢測(cè)，病兒3母親孕13周絨毛膜致病基因檢測(cè)確診胎兒攜帶GAA c.837G>C和c.1598-1599insC復(fù)合雜合突變，終止妊娠。病兒1母親孕18周羊水穿刺GAA檢測(cè)確定胎兒攜帶一個(gè)雜合突變，遺傳咨詢結(jié)果考慮胎兒不會(huì)發(fā)病，現(xiàn)已經(jīng)足月娩出，出生體質(zhì)量約3.4 kg，健康。

A、B、C、D分別為病兒1、2、3、4。

圖14例病兒GAA突變位點(diǎn)測(cè)序圖

3 討 論

GSDⅡ分為早發(fā)型 (嬰兒型)及晚發(fā)型 (青年型及成人型)。晚發(fā)型GSDⅡ多青少年起病，表現(xiàn)為肌力減退和呼吸肌受累等癥狀，罕見(jiàn)心肌受累[4]。早發(fā)型嬰兒期起病，癥狀嚴(yán)重，心肌受累的超聲心動(dòng)圖表現(xiàn)為以左心室心肌肥厚為主的雙心室心肌向心性肥厚，多在1歲以內(nèi)死于心力衰竭。由于嬰兒型早期臨床表現(xiàn)非特異、進(jìn)展迅速、診斷治療時(shí)間窗短[5]，早期快速做出正確診斷對(duì)病兒的治療和預(yù)后有重大意義。本組報(bào)道的4例病兒發(fā)病年齡均在1歲前，伴有肥厚型心肌病和骨骼肌受累，故為早發(fā)型GSDⅡ。

GAA基因突變影響GAA的合成、磷酸化修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)以及分泌，突變性質(zhì)決定殘余GAA活性，GAA活性越低，發(fā)病年齡越早，臨床表現(xiàn)越嚴(yán)重[6]。嬰兒型病兒皮膚成纖維細(xì)胞的GAA活性常低于正常對(duì)照的1%，而晚發(fā)型殘余酶的活性可達(dá)1%～40%[7]。國(guó)內(nèi)有報(bào)道幼年起病的晚發(fā)型GSDⅡ型病兒，但無(wú)心肌肥厚表現(xiàn)[8]。而本組4例病兒均有明顯的心肌肥厚，心功能有不同程度的降低，血肌酸激酶升高較顯著，提示該4例病兒屬于典型的嬰兒型GSDⅡ。

GAA基因的突變型與臨床表型相關(guān)，在該組病兒1中發(fā)現(xiàn)的GAA基因c.1822C>T，p.R608X雜合突變?yōu)镠GMD報(bào)道的已知致病性突變[9-10]；而c.2102T>C，p.L701P雜合突變既往未見(jiàn)報(bào)道，生物信息分析軟件SIFT、PolyPhen2及Mutation_Taster均預(yù)測(cè)該突變可能有害，病兒1臨床發(fā)病，證實(shí)了p.L701P為致病突變。病兒2攜帶的GAA基因c.1822C>T,p.R608X雜合變異，為HGMD報(bào)道的與GSDⅡ相關(guān)的已知變異，人群樣本數(shù)據(jù)篩查在個(gè)例病人中檢出上述變異[11-14]，該變異為無(wú)義變異，造成終止密碼提前出現(xiàn)，提示該變異可能對(duì)蛋白多肽鏈的正常合成有重要影響，該變異在外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù)(ExAC)中的頻率為0.00002479，定義為致病性變異。KOBAYASHI等[15]通過(guò)將重組GAA (rGAA)對(duì)病人進(jìn)行體內(nèi)置換治療，發(fā)現(xiàn)可以減輕早期病人的癥狀。病兒2攜帶的另外一個(gè)GAA基因c.2662G>T,p.E888X雜合變異為HGMD報(bào)道的與GSD相關(guān)的已知變異[15-18]。p.E888X在ExAC中的頻率為0.00002，為致病性變異。本組病兒中有2例攜帶p.E888X，進(jìn)一步證實(shí)該突變?yōu)闊狳c(diǎn)突變。病兒3 GAA外顯子4和11分別檢測(cè)到一個(gè)雜合突變位點(diǎn)c.837G>C，p.Trp279Cys和c.1598-1599insC，p.N535Qfs*3，這兩個(gè)位點(diǎn)在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)中均未見(jiàn)報(bào)道。 c.837G>C突變導(dǎo)致GAA蛋白的第279位氨基酸由色氨酸(Trp)變?yōu)榘腚装彼?Cys)，通過(guò)http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/預(yù)測(cè)其為可能致病。c.1598-1599-insC為移碼突變，導(dǎo)致GAA蛋白翻譯到第537位氨基酸時(shí)終止，形成一個(gè)不成熟的蛋白截短體，影響蛋白正常功能的發(fā)揮，通過(guò)http://www.mutationtaster.org/預(yù)測(cè)該位點(diǎn)為極有可能致病。家系驗(yàn)證結(jié)果顯示，受檢者的父親和母親分別攜帶c.1598-1599insC和c.837G>C，符合遺傳共分離規(guī)律。病兒4樣本分析顯示GAA基因有2個(gè)雜合突變，即c.1802C>T，p.S601L雜合突變以及c.2662G>T，p.E888X雜合突變。這兩個(gè)位點(diǎn)均為HGMD報(bào)道與GSDⅡ相關(guān)的疑似致病性突變[19]。

表1 病兒GAA基因突變結(jié)果

GSDⅡ?yàn)槌Ｈ旧w隱性遺傳，病兒分別攜帶來(lái)自父母的致病突變方可發(fā)病，絨毛、羊水和胎兒血均可提取胎兒DNA用于產(chǎn)前遺傳病診斷。妊娠7～12周可以選擇絨毛膜，縮短診斷周期。妊娠14～22周可以選擇羊水穿刺，羊水取材安全性高、結(jié)果準(zhǔn)確。如果妊娠超過(guò)22周，可以用胎兒血培養(yǎng)。胎兒血培養(yǎng)成功率高，染色體核型形態(tài)好、分裂相多[20]。本組病兒中2例母親孕下一胎，1例妊娠13周取得絨毛膜進(jìn)行GAA測(cè)序后發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶2個(gè)致病位點(diǎn)，終止妊娠。 1例在妊娠18周行羊水穿刺，GAA基因檢測(cè)確定胎兒只攜帶一個(gè)致病基因，繼續(xù)妊娠，順利分娩正常新生兒。

綜上，嬰兒發(fā)病GSDⅡ病兒分別攜帶來(lái)自父母的致病突變，病兒癥狀出現(xiàn)早，未經(jīng)酶替代治療死亡率高。GSDⅡ在我國(guó)尚未列入產(chǎn)前篩查，對(duì)于病兒母親孕下一胎胎兒進(jìn)行GAA基因檢查，有助于GSDⅡ出生缺陷的預(yù)防。

(感謝西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(西安市兒童醫(yī)院)、陜西省兒科疾病研究所楊穎、張李鈺對(duì)本文基因檢測(cè)結(jié)果分析的幫助)