王 鍵,宋瑞鵬,孫 丹

肝臟氧化應(yīng)激損傷能引起肝星狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能改變，而肝星狀細(xì)胞活化是引起肝纖維化的主要原因[1]。故尋找能夠有效延緩或減輕肝星狀細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的藥物是本領(lǐng)域研究的熱點。黃芪甲苷是從黃芪中提取的重要單體，具有改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)微循環(huán)，提高超氧化物歧化酶活性，穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用[2-5]。本研究探討黃芪甲苷對肝星狀細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用及相關(guān)機(jī)制，以期為肝纖維化的治療開辟新的研究方向。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 黃芪甲苷(Sigma公司，純度為97%)，大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6 (中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)，H2O2(美國Sigma公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，MTT試劑盒(上海伯奧生物科技有限公司)，H2DCFDA染色試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)，Hoechst-PI雙染試劑盒(南京建成生物研究所)，Caspase-3、Caspase-9抗體(上海碧云生物技術(shù)有限天公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)中，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%；每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，2～3 d換液1次。

1.2.2藥物處理及實驗分組：對照組不做任何處理,氧化損傷組用100 μmol/L的H2O2孵育24 h,黃芪甲苷低濃度組用100 μmol/L黃芪甲苷孵育24 h后加入100 μmol/L 的H2O2孵育12 h,黃芪甲苷高濃度組用200 μmol/L黃芪甲苷孵育24 h后加入100 μmol/L的H2O2孵育12 h。

1.2.3MTT法測定細(xì)胞增殖情況：取處于對數(shù)生長期的肝星狀細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1×104個/L，每孔200 μl，向各孔細(xì)胞中加入10 μl MTT(5 g/L)，4 h后吸出上清液，加入100 μl DMSO溶液，低速振蕩10 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔570 nm的光密度(OD)值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測肝星狀細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)表達(dá)：肝星狀細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，0.1%胰酶消化各組細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液。1000 r/min離心后收集細(xì)胞，加入5 μl H2DCFDA染料后充分混勻避光反應(yīng)15 min，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量。

1.2.5Hoechst-PI染色觀察細(xì)胞凋亡：肝星狀細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后用PBS洗滌2次，在150 μl的Binding Buffer中加入2 μl Hoechst-PI染液，避光、室溫反應(yīng)5 min后置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6Caspase-3及Caspase-9含量檢測：用0.1%胰酶消化細(xì)胞，1200 r/min離心10 min，收集細(xì)胞并用PBS沖洗2次，加入30 μl細(xì)胞裂解液后冰上孵育20 min，10 000 r/min離心10 min，按試劑盒說明書，使用721 D分光光度計測定細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9含量。

2 結(jié)果

2.1肝星狀細(xì)胞活性變化 氧化損傷組經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞活性為(30.00±3.50)%，對照組為(96.67±2.98)%。氧化損傷組的細(xì)胞活性低于對照組(P<0.01)。用不同濃度黃芪甲苷處理后，低濃度和高濃度組的細(xì)胞活性分別提高到(54.00±4.22)%和(68.00±3.60)%，均高于氧化損傷組(P<0.01)。不同濃度黃芪甲苷組細(xì)胞活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1黃芪甲苷對H2O2致肝星狀細(xì)胞活性的影響

注：與氧化損傷組比較，bP<0.01

2.2肝星狀細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)變化 對照組細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)均較低，氧化損傷組DCF熒光信號明顯增強(qiáng)，不同濃度黃芪甲苷干預(yù)后，熒光信號強(qiáng)度逐漸減弱。見圖2。

圖2 4組肝星狀細(xì)胞內(nèi)活性氧含量流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果

2.3肝星狀細(xì)胞凋亡情況 未發(fā)生凋亡反應(yīng)的細(xì)胞核為均勻一致的低藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞為亮藍(lán)色熒光，壞死細(xì)胞為紅色熒光。熒光顯微鏡下可見正常細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊集，呈亮藍(lán)色高熒光。氧化損傷組凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，甚至出現(xiàn)紅染的壞死細(xì)胞。氧化損傷組凋亡細(xì)胞比例為(68.00±3.56)%，對照組為(2.00±1.42)%。氧化損傷組凋亡細(xì)胞比例高于對照組(P<0.01)。黃芪甲苷干預(yù)后，凋亡及壞死細(xì)胞逐漸減少。黃芪甲苷低和高濃度組凋亡細(xì)胞比例分別為(51.67±4.86)%和(50.67±3.28)%，低于氧化損傷組(P<0.05，P<0.01)。不同濃度黃芪甲苷組凋亡細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 4組肝星狀細(xì)胞凋亡情況(Hoechst-PI染色 ×300)

2.4肝星狀細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9的含量變化 氧化損傷組肝星狀細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9表達(dá)高于對照組(P<0.05)；黃芪甲苷干預(yù)后，肝星狀細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9表達(dá)水平低于氧化損傷組(P<0.01)。黃芪甲苷低濃度組與高濃度組肝星狀細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 黃芪甲苷對肝星狀細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9含量變化的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與氧化損傷組比較，bP<0.05

3 討論

為了研究肝纖維化病變的發(fā)生機(jī)制并探索出更多的治療性藥物，國內(nèi)外學(xué)者嘗試了大量方法誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，如：高糖、化學(xué)藥物、H2O2等[6-7]。為了能更接近人體環(huán)境，本研究模擬肝纖維化患者體內(nèi)環(huán)境中肝星狀細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，利用100 μmol/L的H2O2建立細(xì)胞氧化損傷模型，觀察黃芪甲苷對肝星狀細(xì)胞的保護(hù)作用。

黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分，具有提高記憶力、延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用，臨床主要用于糖尿病、心血管疾病的治療[8-10]。目前，臨床關(guān)于黃芪甲苷治療肝臟疾病的報道并不多，顧明等[11]通過制備大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型后給予黃芪甲苷10～40 mg/(kg·d)腹腔注射進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷通過抑制Caspase-3及Caspase-9表達(dá)，減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷。本研究采用100 μmol/L和200 μmol/L的黃芪甲苷處理鼠肝星狀細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能夠有效抑制H2O2引起的肝星狀細(xì)胞內(nèi)ROS增加，提示黃芪甲苷具有抑制細(xì)胞氧化損傷的作用。黃芪甲苷干預(yù)的肝星狀細(xì)胞活性增加，凋亡細(xì)胞比例降低，提示黃芪甲苷能夠抑制肝星狀細(xì)胞凋亡反應(yīng)的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡是指在病理或者生理因素的影響下，通過激活膜信號通路及啟動相關(guān)程序基因，在降解酶、蛋白酶、核酸酶的作用下，導(dǎo)致細(xì)胞按一定程序控制的破壞和死亡[12-15]。核酸內(nèi)切酶首先被激活，引起細(xì)胞內(nèi)基因組DNA的降解，產(chǎn)生大小不等的核苷酸片段等特征性改變[16]。線粒體與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，當(dāng)線粒體內(nèi)膜通透性改變時，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)膜脫落并流失到細(xì)胞質(zhì)中，從而啟動了細(xì)胞的凋亡過程[17]。細(xì)胞色素C與細(xì)胞凋亡的關(guān)系十分密切，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1和Caspase-9組成了凋亡復(fù)合體，共同活化Caspase-3，作用于不同的靶目標(biāo)，最終引起細(xì)胞凋亡[18]。本研究中，黃芪甲苷作用于肝星狀細(xì)胞后，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)相對于氧化損傷組均降低，提示黃芪甲苷通過改變抗凋亡因子表達(dá)抑制了肝星狀細(xì)胞凋亡。

綜上所述，黃芪甲苷有望成為治療肝臟纖維化的有效藥物，為該病的臨床治療提供新思路。