李 靖，王艷麗，劉恩岐

(1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部高原相關(guān)疾病分子遺傳機(jī)制與干預(yù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712000； 2.西安醫(yī)學(xué)院病理教研室，西安 710021； 3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710061)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件。目前，幾乎所有生命科學(xué)領(lǐng)域的科研、教學(xué)、生產(chǎn)、鑒定、安全評(píng)價(jià)和成果評(píng)定都離不開實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步作出了巨大貢獻(xiàn)[1-2]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇通常要遵循標(biāo)準(zhǔn)原則、相似性原則、差異性原則、相從或相匹配原則、易化性原則、可行性原則、規(guī)格化原則等諸多原則[3]，其中相似性原則是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義的首要前提。基于此，本研究從形態(tài)特征和組織學(xué)特點(diǎn)入手比較了小鼠、大鼠、豚鼠、家兔這四種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝與人肝的相似性，以期對(duì)肝研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠10只，體重27～38 g，2.5月齡；SPF級(jí)SD大鼠6只，體重370～445 g，5月齡[SCXK (陜) 2014-003]。普通級(jí)短毛豚鼠5只，體重287～327 g，2.5月齡；普通級(jí)日本大耳白兔4只，體質(zhì)量3020～3140 g，6.5月齡[SCXK (陜) 2015-003]。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為雄性，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠、大鼠、豚鼠、家兔的無(wú)菌手術(shù)在西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK (陜) 2015-002]。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，本實(shí)驗(yàn)研究IACUC號(hào)：XJTU2011041。

1.2 主要試劑與儀器

任氏液、酒精伊紅染色劑、蘇木素染色劑(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；中性樹膠(廣州凱秀貿(mào)易有限公司，SJ-604)。電腦生物組織包埋機(jī)(北京Kedee，KD-BM II)；切片機(jī)(德國(guó)Leica，RM2235)；攤片機(jī)(西安瑞豐儀器設(shè)備有限公司，GTK2001)；顯微拍照系統(tǒng)(日本Olympus，DP27)；圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)；恒溫箱(武漢市武昌實(shí)互儀器廠，JP-600)；電子天平(Mettler Toledo公司，AB104-S)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取材

處死小鼠、大鼠、豚鼠、家兔，處死后分別置于電子天平上稱量體重并記錄數(shù)據(jù)。固定、消毒、輕輕提起腹部皮膚，沿腹中線向上剪開至喉部，用解剖鉗固定兩邊，露出胸腔及腹腔，用骨剪剪開胸骨及膈肌，露出肝，觀察肝在體內(nèi)的自然形態(tài)。取完整肝，稱量肝重量并記錄，用任氏液沖洗后，以自然狀態(tài)置于干凈的白瓷盤內(nèi)，觀察其形態(tài)，顏色，分葉，并拍照記錄。

1.3.2 制作石蠟切片蘇木素-伊紅染色

從每個(gè)肝樣本上切取1 cm × 1 cm × 0.5 cm大小的肝組織，用10%的甲醛固定，脫水、透明與浸蠟、包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色、封固后光鏡下觀察組織形態(tài)[4]。

1.3.4 顯微照片分析

將HE染色切片置于顯微鏡下觀察，選取40倍物鏡下的兩個(gè)不同視野拍攝顯微照片，每張照片中選20個(gè)成像清晰的細(xì)胞，利用圖片分析軟件測(cè)量其細(xì)胞面積，細(xì)胞核面積，進(jìn)而計(jì)算出胞漿面積和核漿比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝形態(tài)特征及分葉比較

解剖取材后，主要觀察肝的外部形態(tài)特征，具體記錄顏色、質(zhì)地、邊緣、形狀、分葉等等。通過典型的形態(tài)特征與人類肝進(jìn)行比較，小鼠、大鼠、豚鼠、家兔的肝(圖1)在顏色、質(zhì)地和邊緣上與人類肝均相似，但在形狀和分葉上，家兔肝的形狀與人的最接近，而豚鼠肝的分葉與人一致，均為五葉[5](表1)。

注：a：小鼠；b：大鼠；c：豚鼠；d：家兔。圖1 四種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝Note. a: Mouse; b: Rat; c: Guinea pig; d: Rabbit.Figure 1 Livers of four commonly used laboratory animals

2.2 肝臟器系數(shù)的比較

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臟器系數(shù)(臟器重量/體重× 100%)是其主要的生物學(xué)特性之一，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇的一個(gè)重要指標(biāo)[6]。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后稱量其體重，解剖取材后稱量其肝重，計(jì)算臟器系數(shù)，與人的臟器系數(shù)進(jìn)行比較，中國(guó)男性肝平均重量為1410 g，占體重2.35%[7]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示豚鼠肝的臟器系數(shù)與人的最接近，大鼠肝次之，小鼠肝的臟器系數(shù)與人的差別最大(表2)。

2.3 肝細(xì)胞核漿比的比較

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝細(xì)胞的核漿比(細(xì)胞核截面積/細(xì)胞截面積)是肝細(xì)胞的主要特性之一，也是肝實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用到的一個(gè)指標(biāo)[8]。整理放大倍數(shù)為400倍的顯微照片，從中挑選成像清晰的照片(圖2)，每張照片中選20個(gè)細(xì)胞，利用圖片分析軟件測(cè)量其細(xì)胞面積，細(xì)胞核面積，進(jìn)而計(jì)算出胞漿面積和核漿比，與章宗籍等人[9]測(cè)得的正常人肝的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示家兔肝細(xì)胞的核漿比與人的最接近，大鼠次之，豚鼠肝細(xì)胞的核漿比與人的差異最大(表3)。

3 討論

在生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常需要使用動(dòng)物，尤其是醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域內(nèi)，許多試驗(yàn)工作，必須借助于動(dòng)物。因?yàn)閯?dòng)物有許多種生物學(xué)反應(yīng)與人相似，雖不能完全一樣，但可作依據(jù)或參考[1]。以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為研究對(duì)象的研究方法也越來(lái)越多，所以，盡量選擇與人類相似的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象已成為決定實(shí)驗(yàn)成敗的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)興起的一個(gè)重要原因。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇主要遵循以下幾點(diǎn)：一是盡量選擇研究對(duì)象的功能、代謝、結(jié)構(gòu)及疾病性質(zhì)與人類相似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；二是選擇解剖、生理特點(diǎn)符合實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊蟮膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物；三是根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同品種、品系的特點(diǎn)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；四是根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的要求選擇標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；五是符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇的一般原則(性別、年齡、體重、生理狀況與健康狀況、實(shí)驗(yàn)條件等)；六是經(jīng)濟(jì)性原則[10]。

表1 四種常見實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的肝形態(tài)特征比較Table 1 Morphological characteristics of the liver from four commonly used laboratory animals compared with those of human

表2 四種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人肝臟器系數(shù)的比較Table 2 Liver coefficient in four commonly used laboratory animals compared with that of human

圖2 四種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織的HE染色切片(× 400)Figure 2 HE staining of liver tissues of four commonly used laboratory animals

表3 四種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人肝細(xì)胞核漿比的比較Table 3 Nucleoplasm ratio of the liver from four commonly used laboratory animals compared with that of human

本實(shí)驗(yàn)所選的四種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別為：小鼠，哺乳綱、嚙齒目、鼠科、小鼠屬；大鼠，哺乳綱，嚙齒目，鼠科，大鼠屬；豚鼠，哺乳綱、嚙齒目、豚鼠科、豚鼠屬；家兔，哺乳綱、兔形目、兔科、穴兔屬。以上四種動(dòng)物均為生命科學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。從親緣關(guān)系來(lái)看，小鼠、大鼠、豚鼠為哺乳綱、嚙齒目，家兔為兔形目，與人類的親緣關(guān)系均相似。但有實(shí)驗(yàn)通過研究耳蝸中存在的PDE基因在不同組織的表達(dá)情況得到結(jié)論：與小鼠和家兔相比豚鼠與人PDE基因序列同源性更高，提示豚鼠與人可能有著更近的親緣關(guān)系，此研究從另外一個(gè)角度上增強(qiáng)了豚鼠作為疾病研究模式的可行性[11]。小鼠作為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其在肝研究方面的應(yīng)用非常廣泛，不僅可作為肝癌等肝疾病模型動(dòng)物[12]，還有研究使用人源化小鼠和人肝嵌合體小鼠進(jìn)行肝疾病的研究[13]，這也為肝疾病研究提供了新的思路。有研究也使用大鼠作為高脂高鐵誘導(dǎo)肝纖維化的動(dòng)物模型[14]。近年來(lái)，家兔也被用作動(dòng)脈粥樣硬化及肝脂代謝相關(guān)疾病的動(dòng)物模型[15 -16]。從肝組織形態(tài)特征來(lái)看，大鼠的肝缺少膽囊，不能選作膽囊方面及與膽囊相關(guān)方面的研究。家兔的肝外形與人類相似，而豚鼠的分葉情況和臟器系數(shù)均與人類最接近。從肝細(xì)胞核漿比來(lái)看，家兔的肝細(xì)胞核漿比與人類最接近。此結(jié)果提示在肝相關(guān)研究中使用豚鼠和家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可能更為合理。