呂龍寶，陳麗雄，王俊斌，劉汝文，陳麗玲

(1.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物所，昆明 650032； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，昆明 650500； 4.昆明醫(yī)科大學(xué)臨床技能中心，昆明 650500)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高、生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，肉食增加導(dǎo)致脂肪肝、膽囊結(jié)石的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為臨床中的常見病、多發(fā)病。膽囊結(jié)石形成的機(jī)制尚不十分清楚[1]。膽囊結(jié)石動(dòng)物模型建立方法簡(jiǎn)單、效果確切，可以為研究膽結(jié)石成因及其防治提供巨大方便。樹鼩在眾多的人類疾病替代模型中，很少有人用其研究膽囊結(jié)石。飲食誘導(dǎo)樹鼩膽囊膽固醇結(jié)石形成過(guò)程中，消化道屏障功能可能存在異常，雖然樹鼩食物排空比其它動(dòng)物快，但成模周期相對(duì)快速。本文從消化道P物質(zhì)(substance P，SP)的免疫組織含量分析研究樹鼩膽石癥的相關(guān)性及其膽石模型的建立方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

據(jù)3R原則盡量減少動(dòng)物使用量，從中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買36只普通級(jí)成年樹鼩Ⅰ級(jí)(F3代)，規(guī)格：雌∶雄(1∶1)，體重121～140 g[SCXK (滇) K2017-003]。分組：對(duì)照組6只，膽固醇低、中、高劑量組各10只樹鼩。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)在中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的普通環(huán)境2周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；樹鼩采用單籠飼養(yǎng)，人工光照12 h(時(shí)間07:00～19:00)擬黑夜、白天交叉光照，飼養(yǎng)房中室溫控制在(21±3)℃，相對(duì)濕度40%～60%[SYXK (滇) K2017-008]，讓樹鼩自由飲水和采食。每天打掃清理飼養(yǎng)籠具一次，預(yù)飼養(yǎng)后正常開始實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)方案研究經(jīng)由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)審批，通過(guò)中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：KPRC-2017006)。

1.2 主要試劑與儀器

飼料及處理：基礎(chǔ)樹鼩飼料來(lái)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按照美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)嚙齒類AIN-93標(biāo)準(zhǔn)配方改制[2]：含粗蛋白23.1%，粗脂肪6%。制石飼料為基礎(chǔ)飼料加10%豬油，0.5、1.0、1.5%膽固醇分A、B、C三個(gè)劑量組合成小顆粒飼料。

戊巴比妥鈉(上?；瘜W(xué)試劑公司，進(jìn)口分裝，批號(hào)：F20140915)；Bouins液(自制：苦味酸飽和水溶液75 mL，甲醛25 mL，冰醋酸5 mL)；tween-20(濟(jì)寧中堅(jiān)科技有限公司，批號(hào)：9005645)；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(批號(hào)：1E31-20 2016923)；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(批號(hào)：3K33-21 2016923)；甘油三酯(TG)(批號(hào)：7D74-21 2016423)；總膽固醇(TC)(批號(hào)：7D62-21 2016423)。雅培Ci16200全自動(dòng)生化分析儀；徠卡RM2235型切片機(jī)；Olympus顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 指標(biāo)采集

所有樹鼩在造模后測(cè)量每周的空腹體重。測(cè)量時(shí)必須空腹12 h，裝入保定袋稱凈體重；另外，分別于造模前空腹采股靜脈血1 mL、造模中每4周采股靜脈血1 mL，檢測(cè)空腹?fàn)顟B(tài)下低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)等生化指標(biāo)。所有指標(biāo)檢測(cè)在云南省第一人民醫(yī)院進(jìn)行(雅培全自動(dòng)生化分析儀Ci16200)。

1.3.2 取材

從第4、8周部分樹鼩采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射安樂(lè)死，然后取材按消化道從上至下各段：先用生理鹽水沖洗干凈，再依次切下從食管取到直腸。將所有樣本用Bouins液改良后固定，固定液覆蓋樣本超出3 cm高，固定24 h，用80%、95%、100%的乙醇脫水、用二甲苯漸續(xù)透明，浸蠟(恒溫55℃)3 h包埋，取出蠟塊放冰箱固定，修蠟塊切片，按5 μm厚切，用毛筆挑起切片放于43℃水中展片，用鉻礬明膠貼在干凈的載玻片上，放于溫箱調(diào)于37℃烘片備用。取膽囊和膽汁常規(guī)病理切片檢測(cè)結(jié)石情況。

1.3.3 免疫組織化學(xué)方法

常規(guī)石蠟切片脫蠟復(fù)染。先消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，切片放入37℃ 3% H2O2甲醇溶液孵育15 min，然后滴加山羊血清封閉液，置于室溫孵育20 min，意在封閉非特異性反應(yīng)區(qū)。甩去多余液體，滴上一滴一抗50 μL(稀釋倍數(shù)為1∶50 SP抗血清)，置載玻片于室溫靜置1 h或4℃過(guò)夜。如在4℃過(guò)夜需要在37℃復(fù)溫45 min，PBS液沖洗3次，再滴加二抗45～50 μL(稀釋倍數(shù)1∶100羊抗兔IgG·抗血清)，靜置于37℃恒溫水浴鍋1 h。滴加0.05% tween-20。滴加顯色液DAB-H2O25～10 min，顯微鏡下觀察染色深淺，PBS液沖洗3次10 min，用蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗10～15 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組血脂測(cè)定結(jié)果

對(duì)照組與模型組樹鼩不同時(shí)間段血脂指標(biāo)變化見表1。各組血脂測(cè)定結(jié)果顯示：模型組與對(duì)照組比較，第4周和第8周TC濃度升高差異有顯著性(P< 0.01)；模型組第8周與第4周比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，說(shuō)明模型組在第4周時(shí)血液總膽固醇含量已處于較高水平，繼續(xù)喂含高膽固醇的飼料并不能進(jìn)一步增高血液總膽固醇濃度。模型組與對(duì)照組比較，第4周和第8周TG濃度升高差異有顯著性(P< 0.05)；模型組與對(duì)照組比較，第4周和第8周HDL-C降低差異有顯著性(P< 0.01)，LDL-C升高差異有顯著性(P< 0.01)。

2.2 樹鼩成活、成石情況

比較發(fā)現(xiàn)飼料含1.0%膽固醇飼養(yǎng)樹鼩成模較好，死亡率較低，結(jié)果見表2。

2.3 模型組與對(duì)照組膽囊的SP含量比較結(jié)果

用ABC免疫組織化學(xué)法，根據(jù)著色深淺，區(qū)別組織中SP含量；膽囊組織切片中細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃色顆粒，屬于SP蛋白陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)黃色顆粒是陰性。使用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)半定量檢測(cè)其陰、陽(yáng)性蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱，用平均光密度值大小表達(dá)強(qiáng)弱，密度值越大反映細(xì)胞內(nèi)SP蛋白表達(dá)量越多；平均光密度值越低，膽囊組織SP蛋白表達(dá)結(jié)果越弱。結(jié)果見表3。

2.4 樹鼩膽囊膽固醇結(jié)石4～8周組織變化

經(jīng)比較，選擇較好的組織圖片，如圖1所示。組織圖片顯示：對(duì)照組膽囊組織P物質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)較多； 4周模型B組膽囊內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，有絮狀網(wǎng)形成，膽汁渾濁； 8周模型B組膽固醇晶體沉積，有積聚狀態(tài)即可行成核團(tuán)框架石頭；模型B組膽囊組織P物質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)減少，結(jié)石形成。結(jié)果如圖1。

表1 樹鼩不同時(shí)間段血脂指標(biāo)變化Table 1 Changes of blood lipid index in tree shrews in different time periods

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表2 不同劑量膽固醇飼養(yǎng)8周各組動(dòng)物成模率、死亡率比較Table 2 Comparison of model success rates and mortality rates of tree shrews in each group after feeding for 8 weeks with different doses of cholesterol

表3 模型組與對(duì)照組膽囊的SP含量比較Table 3 Comparison of SP content in gallbladder between model groups and control group

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A： 4周模型B組膽囊(HE染色，× 40)；B：8周模型B組膽囊內(nèi)膜(HE染色，× 40)；C：4周對(duì)照組膽囊內(nèi)膜(HE染色，× 200)；D：8周模型B組膽囊內(nèi)膜(HE染色，× 200)；E：4周模型B組晶體(HE染色，× 200)；F：8周模型B組晶體(HE染色，× 200)；G：4周對(duì)照組SP表達(dá)；H：4周模型C組SP表達(dá)；I：8周對(duì)照組SP表達(dá)；J：8周模型B組SP表達(dá)。圖1 不同時(shí)間膽囊內(nèi)結(jié)構(gòu)變化Note. A: Gallbladder at 4 weeks in model group B (HE staining, × 40); B: gallbladder endometrium at 8 weeks in model group B (HE staining, × 40); C: intima at 4 weeks in the control group (HE staining, × 200); D: endometrium at 8 weeks in model group B (HE staining, × 200); E: crystal at 4 weeks in model group B (HE staining, × 200); F: crystal at 8 weeks in model group B (HE staining, × 200). G: SP expression at 4 weeks in the control group; H: SP expression at 4 weeks in model group C; I: SP expression at 8 weeks in the control group; J: SP expression at 8 weeks in model group B.Figure 1 Changes in the structure of the gallbladder at different time

3 討論

高膽固醇飼料飼養(yǎng)樹鼩，經(jīng)稱重觀察樹鼩體重增重并不明顯(數(shù)據(jù)未顯示)；第4周血清脂肪代謝指標(biāo)與對(duì)照組比較差異有顯著性(P< 0.05)；采血后部分樹鼩出現(xiàn)精神萎靡，快速取材發(fā)現(xiàn)形成脂肪肝，膽囊內(nèi)已形成晶體絮狀物。實(shí)驗(yàn)表明含1.0%膽固醇的飼料飼喂樹鼩易制作膽石疾病模型。采用樹鼩建此模型比豚鼠、兔子與人類同源性更近，據(jù)資料通過(guò)基因組分析發(fā)現(xiàn)樹鼩在神經(jīng)及免疫系統(tǒng)的分子信號(hào)通路與人類具有較高的同源性，在很多方面具有可用來(lái)替代靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)[3-4]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析：樹鼩腸道P物質(zhì)隨著膽固醇含量的增高出現(xiàn)了低表達(dá)?？赡苁且蛐∧c蠕動(dòng)傳輸速率減緩，十二指腸、空腸內(nèi)P物質(zhì)的含量明顯減少[5]。表明高膽固醇飼料對(duì)消化道平滑肌有強(qiáng)烈刺激作用，P物質(zhì)的表達(dá)也隨刺激而產(chǎn)生變化，其受體可直接作用于縱行肌、環(huán)行肌引起收縮，增強(qiáng)結(jié)腸袋推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)；P物質(zhì)表達(dá)降低時(shí)，膽囊收縮減慢，胃腸功能紊亂，胃腸運(yùn)動(dòng)功能障礙[6]。消化道黏膜缺血致缺氧損傷，缺血使炎性因子黏附腸道粘膜，產(chǎn)生內(nèi)毒素和二胺氧化酶進(jìn)入血液，導(dǎo)致部分靶器官感染，測(cè)定腸組織P物質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)減少，繼而也出現(xiàn)膽道感染，膽囊炎是促成脂肪肝、膽囊結(jié)石原因之一[7]。說(shuō)明P物質(zhì)的變化與胃腸消化道動(dòng)力及脂肪肝之間有一定的相關(guān)性。

P物質(zhì)是在分子水平上已測(cè)得的作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管擴(kuò)張肽，其消化道十二指腸表達(dá)減少，門脈高壓增加，P物質(zhì)可能參與失代償性肝硬化患者血液動(dòng)力學(xué)改變的發(fā)病機(jī)制[8]。樹鼩內(nèi)環(huán)境的改變是導(dǎo)致門靜脈高壓和膽囊內(nèi)膽汁淤積、膽固醇濃縮形成結(jié)石的主要原因。樹鼩采食高膽固醇食物導(dǎo)致磷脂、膽汁酸、膽固醇形成平衡的比例被打破，低密度脂蛋白(LDL)增多，膽固醇含量升高，膽固醇也隨之增加，導(dǎo)致膽汁中磷脂、膽鹽、膽固醇三者比例失調(diào)，中性脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，肝細(xì)胞功能受到影響，不能產(chǎn)生足夠多的膽汁酸，促使膽囊結(jié)石形成[6]。從而造成膽汁中的膽固醇也相應(yīng)增加。正常情況下機(jī)體膽固醇能夠在膽汁中“溶解”。在體內(nèi)可以形成“磷脂膽固醇泡”，也叫“轉(zhuǎn)運(yùn)泡”，這是一種由膽固醇和磷脂一起組成的復(fù)合物[9]。當(dāng)膽固醇含量相對(duì)增多，肝臟中的磷脂合成較少時(shí)，復(fù)合物的合成平衡被打破，多余的膽固醇就形成絮狀物或結(jié)晶，在膽汁中游離與“糖蛋白”凝聚在一起構(gòu)建成結(jié)石的框架，結(jié)石的核心是磷酸鈣、膽紅素鈣聚集一起形成的，這樣逐漸形成膽固醇膽囊結(jié)石[10]。