齊云飛 魏曉菲

(1.菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校，山東 菏澤 274000；2.菏澤市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，山東 菏澤 274000)

國家癌癥中心登記數(shù)據(jù)顯示：通過分析1988年—2005年10個腫瘤登記處的連續(xù)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，年平均增長1.63%[1]，戶外空氣污染、 職業(yè)暴露和居住地附近環(huán)境污染均與肺癌發(fā)病和死亡存在關(guān)聯(lián)，且關(guān)聯(lián)大小受到吸煙、經(jīng)濟狀況、年齡和性別等影響[2]。肺癌發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)多處在中晚期，即使經(jīng)過手術(shù)切除、放射和化學(xué)療法等，5年生存率仍然較低。因此肺癌的預(yù)防顯得尤為重要。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)硒、類胡蘿卜素、維生素E 等抗氧化劑的攝入能預(yù)防肺癌的發(fā)生[3]，肺癌、前列腺癌、和結(jié)腸癌的發(fā)生率可通過補硒而下降，但臨床試驗也具有爭議的結(jié)果[4-5]。因此探討硒與肺癌發(fā)生的機制對研究硒能否預(yù)防腫瘤有重要的理論和實踐意義。前期研究證明硒治療腫瘤的機制與硒具有抗氧化，抑制腫瘤細胞凋亡有關(guān)[6]，故本研究探討亞硒酸鈉抑制肺癌A549細胞增殖、促進其凋亡的機制。因為細胞凋亡與細胞線粒體內(nèi)細胞色素C(Cyt-C)釋放有關(guān)，故我們推論亞硒酸誘導(dǎo)肺癌細胞A549凋亡與凋亡相關(guān)蛋白Cyt-C有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料和試劑

A549人肺癌細胞細胞株、新生牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基分別購自南京凱基生物公司、杭州四季青生物有限公司和美國Gibco公司，亞硒酸鈉為美國Sigma 公司產(chǎn)品，小鼠抗人細胞色素C抗體購自英國Abcam公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司。

1.2細胞培養(yǎng)和分組

A549人肺癌細胞株，復(fù)蘇接種于RPMI 1640 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液含10%新生牛血清，青霉素、鏈霉素各 l×105U/L，置5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃常規(guī)培養(yǎng)。取A549對數(shù)生長期的細胞，分為5組，分別加硒(0 μmol/L，0.5 μmol/L，2.5 μmol/L，5.0 μmol/L和8.0 μmol/L亞硒酸鈉)，培養(yǎng)24 h、48 h后檢測實驗結(jié)果。

1.3MTT檢測亞硒酸鈉對肺癌細胞株A549的增殖的影響

在104/孔的濃度將對數(shù)生長期A549細胞接種于96孔板。待24 h細胞貼壁后，分別加入含亞硒酸鈉0 μmol/L，0.5 μmol/L，2.5 μmol/L，5 μmol/L和8 μmol/L的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24 h、48 h，每個濃度設(shè)重復(fù)孔6個，然后MTT法檢測A549細胞吸光度，在酶標(biāo)儀490 nm處讀取A549細胞吸光度值，實驗重復(fù)3次。A549細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4亞硒酸鈉對肺癌A549細胞凋亡相關(guān)蛋白Cytc表達的影響

收集A549對數(shù)生長期的細胞，將細胞培養(yǎng)于蓋玻片上，待細胞貼壁后，細胞密度為60%～70%左右時，實驗組加提前配置的亞硒酸鈉培養(yǎng)液，做3個平行孔，再培養(yǎng)24 h和48 h，收集蓋玻片上A549細胞，4%多聚甲醛固定，加入1∶100濃度的小鼠抗人細胞色素C抗體，SP(streptavidin-perosidase)法進行免疫細胞化學(xué)染色。同樣培養(yǎng)細胞后提取全細胞蛋白，用免疫印跡法檢測A549細胞Cytc含量。

1.5TUNEL末端標(biāo)記檢測肺癌A549凋亡

在肺癌A549對數(shù)生長期收集細胞，加入含亞硒酸鈉0 μmol/L，0.5 μmol/L，2.5 μmol/L，5.0 μmol/L和8.0 μmol/L的培養(yǎng)液24 h和48 h。4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，按照TUNEL Roche試劑盒說明書檢測有不同濃度的亞硒酸鈉對A549凋亡的作用。

1.6結(jié)果分析

每種濃度、24 h和48 h 兩個時間點，Cytc免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果隨機拍照5張，實驗重復(fù)3次共拍照15張，同IPP6.0 圖像分析軟件對每張照片進行吸光度檢測，計算15張圖片的均值，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。A549細胞TUNEL末端標(biāo)記染色結(jié)果用同樣的方法進行拍照，計算其吸光度值，以β-actin作為內(nèi)參照，統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

以上均數(shù)選用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，SNK-q檢驗用于組間兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P≤0.05表示兩組數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測亞硒酸鈉對肺癌細胞株A549的增殖的影響

用不同濃度的亞硒酸鈉培養(yǎng)液培養(yǎng)人肺癌A549細胞株24 h，48 h后，A549細胞的吸光度值的檢測結(jié)果(見圖1)，可見MTT吸光度值隨著亞硒酸鈉濃度的增加逐漸呈現(xiàn)降低的趨勢。0 μmol/L，2.5 μmol/L，5.0 μmol/L亞硒酸鈉組在24 h和48 h兩個時間點雖然隨著時間的延長吸光度有所下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義；8 μmol/L亞硒酸鈉組觀察到培養(yǎng)48 h比24 h的吸光度顯著下降(P<0.05)，肺癌A549細胞的數(shù)量也亞硒酸鈉濃度依賴性的和時間依賴性的越來越少。通過公式(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，計算抑制率見(圖2)。A549細胞生長抑制率隨著亞硒酸鈉濃度的升高時間依懶性的逐漸增高。

注：a空白對照組比較P<0.05,b空白對照組比較P<0.01

符號不同·，具有顯著性，P<0.05

2.2亞硒酸鈉對Cytc蛋白表達的影響(圖3～7)

Cytc蛋白免疫細胞化學(xué)染色顯示：Cytc陽性定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒(圖3～圖4)。IPP6.0 圖像分析結(jié)果(圖5)隨著亞硒酸鈉濃度和培養(yǎng)時間的增加Cytc蛋白免疫細胞化學(xué)染色的平均光密度增加，Western blot印跡法檢測圖像分析結(jié)果(圖6～圖7)也顯示同樣的趨勢。

圖3 加亞硒酸鈉(0 μmol/L，0.5 μmol/L，2.5 μmol/L，5.0 μmol/L，8.0μmol/L)培養(yǎng)24h后Cytc陽性蛋白在肺癌A549 細胞內(nèi)的表達(24h).免疫細胞化學(xué)染色，200×.

圖4 加亞硒酸鈉(0 μmol/L，0.5 μmol/L，2.5 μmol/L，5.0 μmol/L，8.0μmol/L)培養(yǎng)48h后Cytc陽性蛋白在肺癌A549 細胞內(nèi)的表達(24h).免疫細胞化學(xué)染色，200×.

圖5 a與空白對照組比較P<0.01。

圖6 Western blot 顯示肺癌A549細胞內(nèi)Cytc 蛋白含量.

圖7 a與空白對照組比較P<0.05; b 與0.5μmol/L 硒組比較P<0.05，c與2.5μmol/L 硒組比較P<0.05

2.3亞硒酸鈉對肺癌A549凋亡的影響(表1，圖8～圖9) 人肺癌A549凋亡TUNEL染色結(jié)果顯示：TUNEL染色位于A549凋亡細胞核，隨著亞硒酸鈉濃度的增加和時間的延長逐漸加深。圖像分析結(jié)果顯示(表1)，隨著亞硒酸鈉濃度的增加A549凋亡逐漸增加(P<0.05)，但亞硒酸鈉作用肺癌A549 24h或48h后，其凋亡程度沒有顯著的區(qū)別。

圖8 TUNEL染色顯示加亞硒酸鈉培養(yǎng)24h對A549細胞凋亡的影響

圖9 TUNEL染色顯示加亞硒酸鈉培養(yǎng)48h對A549細胞凋亡的影響

表1 不同濃度的亞硒酸鈉對肺癌A549細胞凋亡的誘導(dǎo)作用

注：a空白對照組比較P<0.05

3 討 論

從90年代初，硒長期被認為具有抗癌，抑制DNA損傷，抑制肺癌轉(zhuǎn)移和輻射誘導(dǎo)的致癌作用。但近年來也出現(xiàn)了具有爭議的結(jié)果。最近Jablonska等[7]報道，硒能否降低患肺癌的幾率，可能與患者的基因型有關(guān)；另有實驗表明補硒能否降低腫瘤的發(fā)病率還可能與性別有關(guān)。為此我們研究了不同濃度(0.5 μmol/L,2.5 μmol/L，5.0 μmol/L，8.0 μmol/L)亞硒酸鈉對A549細胞株的影響，本實驗發(fā)現(xiàn)MTT吸光度值隨著亞硒酸鈉濃度的增加逐漸呈現(xiàn)降低的趨勢。0 μmol/L，2.5 μmol/L，5.0 μmol/L亞硒酸鈉組在24 h和48 h兩個時間點雖然隨著時間的延長吸光度有所下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義；8 μmol/L亞硒酸鈉組觀察到培養(yǎng)48h比24h的吸光度顯著下降，肺癌A549細胞的數(shù)量也亞硒酸鈉濃度依賴性的和時間依賴性的越來越少。說明亞硒酸鈉能夠抑制肺癌細胞的生長，抑制率隨著亞硒酸鈉濃度的升高時間依懶性的逐漸增高。

亞硒酸鈉抑制A549細胞生長的機制主要與硒化合物可通過細胞毒作用和誘導(dǎo)細胞凋亡的方式直接作用腫瘤細胞有關(guān)[8]。硒化合物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制還不清楚[9-10]?！凹毎蛲?apoptosis)”是“程序性細胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)”的形式之一,是細胞一種生理性、主動性的細胞“ 自殺行為”[11]。它可以清除多余、無用、畸變甚至癌變的細胞，來維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。為此我們用TUNEL末端標(biāo)記的方法，探索0 μmol/L，0.5 μmol/L，2.5 μmol/L，5 μmol/L和8μmol/L亞硒酸鈉對人肺癌A549凋亡的作用，結(jié)果顯示隨著亞硒酸鈉濃度的增加A549凋亡逐漸增加(P<0.05),亞硒酸鈉能促進A549細胞株的凋亡。

線粒體途徑是內(nèi)源性細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，細胞色素 C是線粒體呼吸鏈中的電子傳遞體，在細胞凋亡啟動時線粒體膜穩(wěn)定性較差,細胞色素C從線粒體釋放，促進細胞凋亡[12]。為此我們檢測了亞硒酸鈉對細胞質(zhì)細胞色素C含量的影響，結(jié)果顯示免疫組織化學(xué)和Western blot印跡法檢測圖像分析結(jié)果均顯示Cytc免疫細胞化學(xué)染色的吸光度程度和蛋白表達強度均升高，說明亞硒酸鈉可以作用于肺癌細胞株的線粒體膜，使肺癌A549細胞株內(nèi)Cytc從線粒體釋放，合成也增多，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，亞硒酸鈉濃度依賴性的抑制A549細胞增殖，誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，機制可能與亞硒酸鈉誘導(dǎo)A549細胞線粒體膜穩(wěn)定性降低，促進Cytc蛋白由線粒體釋放的細胞質(zhì)有關(guān)。