徐 兵，王夏斌

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

鯽魚(yú)（Carassius auratus）是我國(guó)一種重要的傳統(tǒng)淡水魚(yú)類(lèi)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域占有一席之地.我國(guó)絕大部分地區(qū)都有鯽魚(yú)的大規(guī)模養(yǎng)殖，但主要分布在東部、中部和南部地區(qū)［1-2］.正確合理地防治細(xì)菌性魚(yú)病是提高漁業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)效益的必要措施.國(guó)內(nèi)王艷萍［3］等人利用實(shí)驗(yàn)室的5株標(biāo)準(zhǔn)菌株論證了該方法的可行性.黃文明［4］等從發(fā)病的胭脂魚(yú)病變部位成功分離獲得兩株細(xì)菌，利用16S rRNA基因序列分析手段成功鑒定得到了兩種致病菌.而目前國(guó)內(nèi)尚未有將這一技術(shù)運(yùn)用到水產(chǎn)防治檢測(cè)方面的報(bào)道，本文通過(guò)16S rRNA基因技術(shù)鑒定鯽魚(yú)病原細(xì)菌來(lái)進(jìn)一步證實(shí)16S rRNA基因序列分析技術(shù)在臨床非典型細(xì)菌鑒定方面的應(yīng)用價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料和試劑

試驗(yàn)原料：常熟沙家浜水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的致病鯽魚(yú)

試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、瓊脂糖、TAE緩沖液、PCR試劑盒、電泳試劑盒等

1.2 儀器與設(shè)備

單道可變量程移液槍?zhuān)篏erman eppebdof Co.，Ltd；全溫振蕩培養(yǎng)箱QHZ-98A：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-260：上海市申賢恒溫設(shè)備公司；美的電磁爐SN2105T：美的集團(tuán)（中國(guó)）有限公司；漩渦混合儀SI-T256型：美國(guó)科學(xué)工業(yè)有限公司；離心機(jī)Centrifuge 5418R：German eppebdof Co.，Ltd；電泳儀（DYPC-31DN）型：六一生物科技（北京）有限公司；PCR儀Mastercycle：German eppebdof Co.，Ltd；DYY-6C型電泳儀電源：六一生物科技（北京）有限公司；Gel Doc? EZ imager凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad中國(guó)公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基配方：牛肉浸出膏1.5 g，蛋白胨5.0 g，氯化鈉2.5 g，蒸餾水500 mL.

固體培養(yǎng)基配方：牛肉浸出膏1.5 g，蛋白胨5.0 g，瓊脂粉10 g，氯化鈉2.5 g，蒸餾水500 mL.

1.3.2 提取細(xì)菌DNA

常規(guī)實(shí)驗(yàn)室提取DNA模板有煮沸法、丙酮法、CTAB法、凍融法等，本實(shí)驗(yàn)是一種相對(duì)快捷的提取方法，模板也能滿足PCR的要求［5-8］.

從致病鯽魚(yú)腸道中用無(wú)菌操作取混合物，3次平板劃線分離，將純化的菌種放置EP管中，用移液槍汲取500 μL的無(wú)菌雙蒸水，加入到EP管中蓋上蓋子，強(qiáng)力震蕩促使細(xì)菌溶解于無(wú)菌水中.將混勻后的EP管放置于水浴鍋下95 ℃水浴5 min，然后取出來(lái)，置離心機(jī)中12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心2 min，以上清液作為模板.

1.3.3 16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增

按照引物（10 μmol/L）2 μL+2 μL、模板5 μL、dNTP（2.5 μmol/L）4 μL、Taq酶0.25 μL、10×PCR buffer 5 μL、無(wú)菌雙蒸水31.75 μL配制50 μL PCR體系.設(shè)置預(yù)變性溫度為95 ℃，變性時(shí)間為5 min，變性溫度時(shí)間95 ℃、30 s，退火溫度時(shí)間55 ℃、30 s，延伸溫度時(shí)間72 ℃、2 min，變性退火延伸3個(gè)過(guò)程循環(huán)30次［9］.

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳

按順序使用移液槍取5 μL的PCR成品和1 μL Loading buffer 混合均勻，加樣于含有1%Andy safe 的瓊脂糖凝膠塊上，設(shè)置100 V電壓、30 min，并置于凝膠成像儀上成像.在1 500 bp和750 bp處出現(xiàn)單一條帶即為有效擴(kuò)增.

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳圖譜結(jié)果及分析

17組實(shí)驗(yàn)樣品在提取DNA以后進(jìn)行了16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、凝膠系統(tǒng)成像后，引物1組在1 500 bp處獲得了單一陽(yáng)性條帶，引物2組在1 000 bp處也獲得了單一條帶，與預(yù)計(jì)片段大小吻合（見(jiàn)圖1）.前1～12為引物1擴(kuò)增的1 500 bp的DNA條帶，而后12個(gè)則是在引物2下擴(kuò)增的DNA條帶.從圖1可以看出這次的條帶都存在上翹的現(xiàn)象.由于本次試驗(yàn)所用電壓為100 V（正常），點(diǎn)樣與載體也都混合均勻，推測(cè)可能是上樣量偏多的緣故.

圖1 1～12號(hào)電泳情況

圖2和圖1大致相同，實(shí)驗(yàn)使用的PCR退火溫度為55 ℃，而適當(dāng)提高退火溫度可增強(qiáng)擴(kuò)增條帶特異性，從而使條帶更加單一.

圖2 13～17號(hào)電泳情況

2.2 序列圖譜處理及分析

使用chromas軟件打開(kāi)測(cè)序結(jié)果，先打開(kāi)上游引物PCR擴(kuò)增的結(jié)果，并對(duì)測(cè)序結(jié)果兩端不穩(wěn)定的峰進(jìn)行裁剪（見(jiàn)圖3和圖4）.再打開(kāi)相應(yīng)下游引物的測(cè)序結(jié)果，同樣對(duì)兩端不穩(wěn)定的峰進(jìn)行去除，可得到一段完整的反向序列.上網(wǎng)進(jìn)行在線的堿基反向序列互補(bǔ)，從而獲得一條正向序列，并與前面的正向序列進(jìn)行拼接，即可得到一段相對(duì)完整的DNA片段.

2.3 序列比對(duì)結(jié)果及分析

表1 16SrRNA基因序列鑒定結(jié)果

本次16個(gè)菌種被鑒定分別屬于4個(gè)菌屬：芽孢桿菌、希瓦氏菌、短波單胞菌、氣單胞菌.其中分離鑒定得到的芽孢桿菌是一類(lèi)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖有益的細(xì)菌群.芽孢桿菌進(jìn)入水體養(yǎng)殖環(huán)境后，可以附著于魚(yú)群表面，也可以生存于魚(yú)類(lèi)的消化道，成為對(duì)魚(yú)類(lèi)機(jī)體有利的群落.芽孢桿菌的增殖會(huì)對(duì)其他有害細(xì)菌形成競(jìng)爭(zhēng)性的抑制，因此提高了水產(chǎn)動(dòng)物的抵抗力，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Bacillus還能夠增強(qiáng)動(dòng)物體的特異性免疫及非特異性免疫能力.

圖3 基因測(cè)序峰圖前端

圖4 基因測(cè)序峰圖后端

2.4 幾類(lèi)鑒定的病原細(xì)菌

Shewanella xiamenensis：和希瓦氏菌屬的其他種一樣同屬革蘭氏陰性細(xì)菌，兼性厭氧，極性單鞭毛運(yùn)動(dòng)，不能形成芽孢.Shewanella xiamenensis首次被分離出來(lái)是在我國(guó)福建省廈門(mén)沿海海洋沉積物中.近些年陸續(xù)從淡水魚(yú)體內(nèi)分離得到這一細(xì)菌，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)不僅是淡水魚(yú)，甚至是海水魚(yú)中分離得到的菌株也能夠在無(wú)鹽的條件下生長(zhǎng)，說(shuō)明希瓦氏菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)嗜鹽的能力來(lái)適應(yīng)外界環(huán)境的需要.然而希瓦氏菌的入侵感染對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的威脅日益嚴(yán)重，有些菌株甚至?xí)鹚a(chǎn)魚(yú)類(lèi)的急性敗血癥，導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)大量死亡.然而當(dāng)前關(guān)于希瓦氏菌在魚(yú)類(lèi)病理學(xué)的研究卻很少［10］.

Aeromonas veronii：氣單胞菌是一類(lèi)在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面被學(xué)者作為重點(diǎn)研究對(duì)象的致病細(xì)菌，它能造成大面積水產(chǎn)動(dòng)物爆發(fā)疾病，其中危害最大的就是細(xì)菌性出血病，該病往往會(huì)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成不可預(yù)計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失.維氏氣單胞菌廣泛存在于河流、池塘及湖泊等大多數(shù)淡水水域以及土壤和水生動(dòng)物體內(nèi)，可引起鯽魚(yú)發(fā)病，大多數(shù)表現(xiàn)為腹水以及出血.此外它也可引發(fā)人的腹瀉、腦膜炎和敗血癥等，情況嚴(yán)重時(shí)甚至可能導(dǎo)致免疫力低下者死亡.維氏氣單胞菌被發(fā)現(xiàn)是一種新的人魚(yú)共患致病細(xì)菌，它不僅對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，甚至對(duì)人類(lèi)的健康也具有一定的危害性［11-12］.最近幾年，越來(lái)越多有關(guān)于維氏氣單胞菌毒力因子的報(bào)告，顯示其菌株的毒性慢慢增強(qiáng)，值得水質(zhì)監(jiān)管部門(mén)重視.

Brevundimonas：短波單胞菌常常生存于河流、湖泊、土壤等環(huán)境中，但它卻是比較罕見(jiàn)的病原細(xì)菌，也是一種目前人類(lèi)罕見(jiàn)的條件致病微生物，可以引發(fā)人體肺炎、敗血癥、皮膚炎癥等.但目前尚未發(fā)現(xiàn)它對(duì)水產(chǎn)鯽魚(yú)養(yǎng)殖的危害.

3 結(jié)論

目前，隨著水產(chǎn)鯽魚(yú)高密度養(yǎng)殖和集約化程度的提升，鯽魚(yú)在養(yǎng)殖過(guò)程中的發(fā)病率和死亡率均有大幅度的上升趨勢(shì)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的危害也越來(lái)越大.而傳統(tǒng)的鑒定技術(shù)因診斷落后及結(jié)果不準(zhǔn)確而存在很大的局限性，導(dǎo)致細(xì)菌性魚(yú)病得不到及時(shí)準(zhǔn)確的診斷與控制.隨著分子技術(shù)的日益成熟，核酸序列分析技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定［13］.因此，核酸分子鑒定技術(shù)也將成為水產(chǎn)致病菌鑒定的一項(xiàng)重要技術(shù).

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從鯽魚(yú)的病變部位挑取細(xì)菌來(lái)分離獲得單菌，使用便捷的方法提取細(xì)菌DNA作為PCR模板進(jìn)行16S片段的擴(kuò)增，并通過(guò)比對(duì)16S rRNA基因片段來(lái)分析鑒定確認(rèn)分離的細(xì)菌種類(lèi)，證實(shí)了將16S rRNA基因序列分析技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)鯽魚(yú)病原細(xì)菌鑒定的可行性，同時(shí)也成功鑒定了一類(lèi)較其他病原菌而言對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖危害較大的細(xì)菌——維氏氣單胞菌.它是目前魚(yú)類(lèi)致病菌研究的一個(gè)熱點(diǎn).對(duì)其快速、準(zhǔn)確的鑒定對(duì)于及時(shí)采取措施、控制病情以及科學(xué)防控，實(shí)現(xiàn)水生動(dòng)物的健康養(yǎng)殖具有重要意義.