季舒婷，謝靜茹，趙 培，劉晶晶，陳義勇

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

松樹蕈（Tricholoma matsutake）又名松蕈、松口菇、松樹菌等，隸屬擔(dān)子菌亞門、口菇科、口蘑屬［1］.研究發(fā)現(xiàn)松樹蕈多糖(Polysaccharides from tricholoma matsutake,TMP) 具有抗腫瘤［2］、美白［3］和抗輻射［4］等作用，具有廣闊的市場(chǎng)開發(fā)前景.分子修飾對(duì)多糖活性有很大的影響，對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾，可以提高多糖的活性［5］.磷酸化修飾是糖類物質(zhì)的一種常見的修飾方法，但是目前關(guān)于松樹蕈多糖修飾研究鮮見報(bào)道.本文對(duì)TMP磷酸化修飾工藝進(jìn)行優(yōu)化，并探討磷酸化松樹蕈多糖( Phosphorylated polysaccharides from tricholoma matsutake，P-TMP）的抗氧化活性，旨在為松樹蕈多糖的研究和開發(fā)提供理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

松樹蕈（蘇州興福齋食品科技有限公司提供）；1,1-二苯基-2-苦苯肼、三羥甲基氨基甲烷（上海楷洋生物技術(shù)有限公司）；三聚磷酸鈉(STPP)、三偏磷酸鈉(STMP)、磷酸二氫鉀、氯化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、過氧化氫、維生素C、硫酸、鉬酸銨等試劑均為市售分析純.

1.2 儀器

ME104E型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；DJ-04粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司生產(chǎn)）；HH-2 智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；752型紫外-可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SHB-B循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司）； DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 松樹蕈多糖（TMP）的提取

將松樹蕈洗凈、干燥、粉碎、過60目篩，按料液比1∶40加入蒸餾水，在80 ℃條件下浸提4 h。將多糖提取液離心（4 500 r/min，10 min），取上清液.將上清液減壓濃縮至一定體積，加上清濃縮液五分之一體積的Sevage試劑（氯仿與正丁醇的體積比為4∶1，mL/mL）劇烈振蕩30 min，去除蛋白，加入4倍體積的95%乙醇，4 °C條件下靜置24 h，離心，沉淀經(jīng)冷凍干燥后得到TMP.

1.3.2 磷酸化松樹蕈多糖制備［6］

將多聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉以質(zhì)量比為 6∶1的比例加入蒸餾水溶解，然后加入10 mL TMP（濃度為0.01 g/mL），調(diào)節(jié)pH 和溫度設(shè)定值后進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)完成后，置于截留分子量為3500 Da的透析袋中透析2 d，透析液經(jīng)減壓濃縮后，用4倍95%乙醇醇沉24 h，沉淀經(jīng)過冷凍干燥，得到磷酸化松樹蕈多糖.

1.3.3 磷酸根含量測(cè)定［7］

采用鉬藍(lán)比色法測(cè)多糖中的磷酸根含量，分別取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 mL不同濃度梯度磷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL比色管中，依次加入去離子水至總體積5 mL，tris緩沖液、定磷試劑（同體積的20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)Vc、3 mol/L硫酸與3%鉬酸銨均勻混合）后置于恒溫水浴鍋中加熱，冷卻后于660 nm處測(cè)吸光度值為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為磷酸根濃度，繪制磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

圖1 磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取磷酸化松樹蕈多糖0.5 g，于600 ℃高溫下灰化2 h，加入0.5 mL HCl溶液（蒸餾水與HCl體積比為1∶1），溶解灰化殘?jiān)?，將灰化樣品溶液移?0 mL的容量瓶中定容后，吸取溶液1 mL于25 mL比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)得吸光度，根據(jù)以下公式計(jì)算磷酸根含量.

磷酸根含量=（0.217 5A-0.007 5）/S ×100%

式中，A為樣品在660 nm處測(cè)得的吸光度，S為樣品的質(zhì)量（g）.

1.3.4 單因素試驗(yàn)

（1）磷酸化試劑比例對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確稱取松樹蕈多糖樣品0.5 g，選用三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質(zhì)量比例分別為6∶1，5∶2，4∶3，3∶4，2∶5，1∶6的磷酸化試劑，在pH6.0、反應(yīng)溫度70 ℃的條件下與多糖反應(yīng)3 h，考察磷酸化試劑比例對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響，確定最佳磷酸化試劑比例.

（2）反應(yīng)溫度對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確稱取松樹蕈多糖樣品0.5 g，在pH6.0、溫度分別為30，50，70，90，100 ℃的條件下與磷酸化試劑（三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質(zhì)量比例為5∶2）反應(yīng)3 h，考察反應(yīng)溫度對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響，確定最佳反應(yīng)溫度.

（3）反應(yīng)pH對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確稱取松樹蕈多糖樣品0.5 g，在溫度70 ℃、pH分別為5，6，8，9，10，11的條件下與磷酸化試劑（三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質(zhì)量比例為5∶2）反應(yīng)3 h，考察反應(yīng)pH對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響，確定最佳反應(yīng)pH.

（4）反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響

準(zhǔn)確稱取松樹蕈多糖樣品0.5 g，在pH9.0、反應(yīng)溫度70 ℃條件下與磷酸化試劑（三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質(zhì)量比例為5∶2）反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為2，3，4，5，6 h，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響，確定最佳反應(yīng)時(shí)間.

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以磷酸根含量為指標(biāo)，磷酸化試劑比例、溫度、時(shí)間、pH為自變量，根據(jù)Box-Benhnken Design中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，研究磷酸化反應(yīng)最佳工藝條件.

1.3.6 紅外光譜分析

分別取一定量充分干燥的TMP和P-TMP，與一定量KBr充分混勻后壓片，在波數(shù)4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，比較TMP與P-TMP的紅外光譜.

1.3.7 松樹蕈多糖的體外抗氧化活性

（1）對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定［8］

分別取不同濃度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液2 mL，與2 mL 0.1mmol/L DPPH（避光，現(xiàn)配現(xiàn)用）室溫混勻，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)吸光度.以無水乙醇替代樣液作空白對(duì)照，按如下公式計(jì)算清除率.

DPPH自由基清除率=［1-（Ai-Aj）/Ao］×100%

式中：Ai為多糖樣液加DPPH溶液的吸光度；Aj為樣液加無水乙醇的吸光度；Ao為乙醇加DPPH溶液的吸光度.

（2）超氧陰離子自由基清除作用的測(cè)定［9］

分別取不同濃度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液1.0 mL置于試管中，加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH8.2）和3.2 mL蒸餾水搖勻，在25 ℃條件下水浴10 min，然后加入10 mmol/L的0.1 mL鄰苯三酚作為樣品組，空白組以0.3 mL 10 mmol/L HCI代替鄰苯三酚，充分搖勻，反應(yīng)3 min后（以加入鄰苯三酚時(shí)開始計(jì)時(shí)），立即加入1滴10 mol/mL的HCl溶液終止反應(yīng)，在325 nm處測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按下式計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率.

式中，A為樣品組測(cè)得的吸光度，A0為空白組測(cè)得的吸光度.

（3）羥基自由基（·OH） 清除作用的測(cè)定［10］

分別取不同濃度（20，50，100，150，200 μg/mL）的TMP和P-TMP多糖溶液2 mL，分別加入1 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）和2 mL水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L），最后加入2 mL H2O2（8.8 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，在25 ℃條件下反應(yīng)1 h.用蒸餾水代替樣品溶液作空白，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)以下公式計(jì)算羥基自由基的清除率.

其中，A0為標(biāo)準(zhǔn)空白管的吸光度，A1為對(duì)照管的吸光度，A2為測(cè)定管的吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 磷酸化試劑比例對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響

圖2 磷酸化試劑比例對(duì)磷酸根含量的影響

磷酸化試劑比例對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響見圖2，由圖2可知，添加不同比例的磷酸化試劑所得多糖的磷酸根含量明顯不同.當(dāng)磷酸化試劑比為5∶2時(shí)，磷酸根含量最高為4.134%.因此選擇合適的磷酸化試劑比為5∶2.

2.1.2 溫度對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響

溫度對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響見圖3，由圖3可知，當(dāng)溫度在30～90 ℃之間，隨著溫度的升高，磷酸根含量不斷升高，這可能是因?yàn)闇囟壬呤垢叻肿渔I的活性增強(qiáng)，磷酸化試劑利用率隨之增加［11］.當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí)，磷酸根含量達(dá)到最高值為6.618%.當(dāng)溫度繼續(xù)升高，磷酸根含量反而降低，其原因可能是溫度過高會(huì)對(duì)多糖分子結(jié)構(gòu)造成破壞，使其降解［6］.因此選擇合適的反應(yīng)溫度為90 ℃.

圖3 溫度對(duì)磷酸根含量的影響

2.1.3 時(shí)間對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響

時(shí)間對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響見圖4，從圖4可以看出，隨著時(shí)間的增加，多糖磷酸根含量也不斷增加，當(dāng)時(shí)間為5 h時(shí)，達(dá)到最大值為7.106%.時(shí)間進(jìn)一步增加，磷酸根含量反而下降，可能是因?yàn)槎嗵窃谳^高的溫度下反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖降解，從而磷酸根含量減少［6］.因此選擇5 h為適宜的反應(yīng)時(shí)間.

圖4 時(shí)間對(duì)磷酸根含量的影響

2.1.4 pH對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響

pH對(duì)磷酸化反應(yīng)的影響見圖5，由圖5可知，當(dāng)pH為9.0時(shí)，磷酸根含量達(dá)到最大值7.529%.當(dāng)pH小于9時(shí)，磷酸根含量隨著pH的升高而升高.當(dāng)pH大于9.0時(shí)，磷酸根含量隨著pH的升高而降低.其原因可能是在較低pH條件下，三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉不穩(wěn)定，會(huì)分解生成焦磷酸鈉和正磷酸鈉，使多糖磷酸根含量降低.而pH過高時(shí)可能磷酸化試劑和多糖發(fā)生酯化反應(yīng)進(jìn)而對(duì)磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生不利影響［12］.因此選擇適宜的pH為9.

圖5 pH對(duì)磷酸根含量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面因素水平的選取及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以磷酸化試劑比例（A）、溫度（B）、時(shí)間（C）、pH（D）為自變量，磷酸化松樹蕈多糖中磷酸根含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，探討自變量與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系.試驗(yàn)的因素和水平見表1.

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

2.2.2 模型的建立與分析

松樹蕈多糖磷酸化的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，通過使用design-expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到松樹蕈磷酸化多糖對(duì)磷酸化試劑比例（A），溫度（B），時(shí)間（C）和pH（D）的二次多項(xiàng)回歸方程的模型：Y=9.64-0.092A-0.79B+0.073C-0.29D-0.092AB-0.45AC-0.29AD-0.035BC+0.053BD-0.092CD-0.50A2-1.35B2-0.60C2-0.33D2.

表2 松樹蕈多糖磷酸化的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

響應(yīng)面分析方差結(jié)果見表3.該模型的F值為20.49，P<0.000 1，說明擬合的模型達(dá)到極顯著的水平；模型的決定系數(shù)R2=0.953 5，表明該模型的擬合程度較好，用于評(píng)估各因素對(duì)松樹蕈多糖磷酸根含量的影響較為準(zhǔn)確.

從表3還可以看出，試驗(yàn)組合中的各因素中溫度（B）、pH（D）均具有極顯著水平（P<0.05），其中溫度為最大的影響因素.影響程度大小的因素順序?yàn)椋簻囟龋˙）>pH（D）>磷酸化試劑比例（A）>時(shí)間（C）.

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析

試驗(yàn)得到的響應(yīng)面圖見圖6.在曲面圖中，通過圖形可以直觀地看出因素間的交互作用，坡度越大，影響越顯著，反之則影響較小.從圖6分析得出，磷酸化試劑比例（A）與溫度（C）的交互作用顯著，其余交互作用影響不大.

2.2.4 模型的優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，按照回歸模型預(yù)測(cè)可得到松樹蕈多糖磷酸化的最佳工藝條件為：磷酸化試劑比例為5.03∶1.97，溫度為86.98 ℃，時(shí)間為5.10 h，pH8.51，在此反應(yīng)條件下得到的多糖磷酸根含量9.829 9%.為了驗(yàn)證此結(jié)果的可行性，根據(jù)實(shí)際情況修改工藝條件為：磷酸化試劑比例為5∶2，溫度86 ℃，時(shí)間5.1 h，pH9.0，在該條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得多糖磷酸根含量平均值為9.703%，該值與模型預(yù)測(cè)值很接近，驗(yàn)證了該預(yù)測(cè)試驗(yàn)的可靠性.

圖6 兩因素交互作用對(duì)磷酸根含量的影響

2.3 紅外光譜

對(duì)TMP及P-TMP在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果如圖7所示，可以發(fā)現(xiàn)其變化趨勢(shì)和吸收峰變化不大，都在3 423 cm-1處出現(xiàn)-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，在2 922 cm-1處出現(xiàn)-CH2的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 619 cm-1出現(xiàn)C=O的振動(dòng)收縮峰，在1 400處出現(xiàn)吸收峰是因?yàn)镃-H的伸縮振動(dòng).磷酸化后在1 262 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰是P=O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，997 cm-1附近的吸收峰是P-O-C的伸縮振動(dòng)峰，說明磷酸化修飾成功，磷酸化衍生物成功接上磷酸基.

圖7 TMP及P-TMP的紅外光譜圖

2.4 松樹蕈多糖抗氧化活性

2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用

TMP及P-TMP對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖8.由圖8可知，TMP及P-TMP都對(duì)DPPH自由基具有清除作用，且隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，清除能力也隨之增強(qiáng)，并呈正相關(guān).與TMP相比，經(jīng)過磷酸化修飾的多糖P-TMP對(duì)DPPH自由基的清除作用明顯增強(qiáng).原因可能是多糖經(jīng)過磷酸化后其水溶性提高，糖鏈的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而影響多糖的生物活性［13］.

圖8 TMP及P-TMP對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

TMP及P-TMP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用見圖9.由圖9可知，在一定濃度范圍內(nèi)，TMP及P-TMP對(duì)超氧陰離子自由基均具有清除作用，并且與濃度呈正相關(guān).隨著濃度的升高，其清除能力增強(qiáng).與TMP相比，經(jīng)過磷酸化修飾的多糖P-TMP清除能力明顯減弱，其可能原因是磷酸根基團(tuán)的存在改變了化合物的極性，從而導(dǎo)致活性的改變.

圖9 TMP及P-TMP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

2.4.3 對(duì)羥自由基的清除作用

TMP及P-TMP對(duì)羥自由基的清除作用如圖10所示.由圖10可知，TMP及P-TMP對(duì)羥自由基都均有較強(qiáng)的清除作用，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的提高，其清除自由基能力隨之增強(qiáng)，P-TMP對(duì)清除羥自由基的能力明顯強(qiáng)于TMP，其可能原因是TMP經(jīng)過磷酸化修飾后導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，提高了其阻止·OH發(fā)生連鎖反應(yīng)的能力.

圖10 TMP及P-TMP對(duì)羥自由基的清除作用

3 結(jié)論

以松樹蕈為原料，通過熱水浸提法提取松樹蕈多糖，以磷酸根含量為指標(biāo)，探討磷酸化試劑比例（即三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉的質(zhì)量比，g/g）、溫度、時(shí)間、pH對(duì)松樹蕈多糖磷酸化修飾的影響.在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化松樹蕈多糖磷酸化修飾條件，并比較修飾前后松樹蕈多糖的抗氧化活性.結(jié)果表明：松樹蕈磷酸化修飾最佳工藝條件為磷酸化試劑比例5∶2，溫度86 ℃，時(shí)間5.1 h，pH9.0，在該工藝條件下，磷酸化松樹蕈多糖衍生物的磷酸根含量為9.703%.抗氧化結(jié)果表明：TMP及P-TMP對(duì)DPPH、超氧陰離子自由基、·OH自由基均有一定的清除作用，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈正相關(guān)，同TMP相比，P-TMP清除超氧陰離子自由基能力有所下降，但對(duì)DPPH及·OH自由基清除能力有所增強(qiáng).