王 燕，田 薇，劉 穎，靳 欽，張 曙

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，江蘇南通 226001)

肝細(xì)胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年約有60萬新增病例，死亡人數(shù)大于25萬[1]。目前臨床最常見的治療方法仍是手術(shù)切除和肝臟移植，另外腫瘤細(xì)胞對(duì)其化療藥索拉非尼極易產(chǎn)生耐藥性，且該藥毒性較強(qiáng)[2-3]。 因此，鑒定新型的生物分子標(biāo)記對(duì)有效治療肝細(xì)胞癌是必要的。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Daxx)最初是YANG等發(fā)現(xiàn)的一種新型的高度保守蛋白，存在與人體正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，Daxx在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義國內(nèi)鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用組織芯片、免疫組化法及Western blot檢測其在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，探討其表達(dá)在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2017年 6 月5例肝細(xì)胞癌患者手術(shù)切除的新鮮癌組織及正常肝組織，凍存?zhèn)溆谩Ｊ占?010-2012年280例患者的相關(guān)肝組織，其中130例肝細(xì)胞癌組織，18例肝炎組織，32例肝硬化組織及100例正常肝組織，術(shù)前患者均未經(jīng)任何抗腫瘤治療，均有相應(yīng)的臨床病理資料及隨訪記錄，隨訪率達(dá)100%，隨訪截至2017年6月。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，均經(jīng)患者知情同意。

1.2試劑 鼠抗人Daxx抗體購于英國Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購于美國Sigma公司，細(xì)胞核漿蛋白提取試劑盒購于中國碧云天生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購于中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1組織芯片聯(lián)合免疫組織化學(xué)法 收集的患者標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后，制成組織芯片。經(jīng)4 μm切片，脫蠟、水化、微波處理及抗原修復(fù)后，免疫組織化學(xué)行Daxx標(biāo)記。陽性對(duì)照為自身對(duì)照，一抗的同型對(duì)照作為陰性對(duì)照。組織芯片結(jié)果由兩位高年資的病理診斷醫(yī)師在雙盲情況下進(jìn)行結(jié)果判讀。陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。結(jié)果判讀：在高倍鏡下(×400)分別對(duì)每個(gè)位點(diǎn)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)4個(gè)位點(diǎn)，共400個(gè)細(xì)胞，記錄染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占的百分比。染色強(qiáng)度：無著色0分，黃色弱陽性1分，淺棕色中陽性2分，棕褐色強(qiáng)陽性3分；陽性細(xì)胞百分比：≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘，大于或等于1 分為陽性。

1.3.2Western blot 取5例新鮮肝細(xì)胞癌組織及正常肝組織，使用細(xì)胞核漿蛋白試劑盒分別提取提取核漿蛋白，經(jīng)紫外分光光度儀蛋白定量后分別取50 μg進(jìn)行Western blot檢測，內(nèi)參為β-actin。最后加ECL顯色液顯影。

2 結(jié) 果

2.1Daxx在肝細(xì)胞癌中的表達(dá) 在正常肝組織、肝炎組織及肝硬化組織中Daxx蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。在肝細(xì)胞癌中Daxx蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)陽性率為30.8%(40/130)，見圖1；Western blot 結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，見圖2。

表1 Daxx蛋白在正常肝組織、肝炎組織及肝硬化組織中的表達(dá)情況[n(%)]

圖1 免疫組化檢測Daxx在不同分化程度的肝細(xì)胞癌及正常肝組織中的表達(dá)(×400)

A:肝細(xì)胞癌組織；B:正常肝組織；a:核蛋白；b:漿蛋白

2.2Daxx表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Daxx在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與患者AFP、肝炎史、肝硬化史、腫瘤分化程度、TNM分期、門靜脈癌栓及Ki67表達(dá)相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、飲酒史、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小及腫瘤部位不相關(guān)(P>0.05)，見表2。

2.3預(yù)后分析 Kaplan-Meier生存曲線顯示 Daxx陰性組患者的5年總生存期(OS)及無進(jìn)展生存期(PFS)比陽性組更短，見圖3。單因素生存分析顯示 Daxx的表達(dá)程度、TNM分期、門靜脈癌栓及Ki67表達(dá)程度與患者術(shù)后生存期相關(guān)(P<0.05)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析進(jìn)一步顯示Daxx表達(dá)程度、TNM分期及Ki67表達(dá)程度為影響OS及PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3、4。

表2 Daxx表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表2 Daxx表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

表3 單因素和多因素分析肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征與OS的關(guān)系

續(xù)表3 單因素和多因素分析肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征與OS的關(guān)系

表4 單因素和多因素分析肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征與PFS的關(guān)系

圖3 肝細(xì)胞癌患者中Daxx不同表達(dá)的OS及PFS的生存曲線

3 討 論

肝細(xì)胞癌是一種起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，是全球第二大癌癥殺手，第三大癌癥死因，在我國發(fā)病率居世界首位。到目前為止，肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和病死率居高不下，因此有必要尋找更為有效更為安全的生物治療方案。

Daxx基因定位于6號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶3亞帶，全長約315 kb，含有7個(gè)外顯子、6個(gè)內(nèi)含子及4個(gè)結(jié)構(gòu)域(酸性氨基酸結(jié)構(gòu)域1個(gè)、配對(duì)兼性雙螺旋2個(gè)、 SPT結(jié)構(gòu)域1個(gè))，它們共同參與了Daxx的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Daxx蛋白含有740個(gè)氨基酸，由于轉(zhuǎn)錄后修飾的不同，存在3種不同的形式，相對(duì)分子質(zhì)量為120×103、97×103和70×103。

Daxx是一種多功能蛋白，可與多個(gè)蛋白相互作用，共同參與細(xì)胞凋亡。其生物活性的發(fā)揮與其在亞細(xì)胞間的分布、表達(dá)、定位及轉(zhuǎn)位相關(guān)。有研究最初提出Daxx在胞漿中是作為Fas蛋白的下游，參與其凋亡通路發(fā)揮促凋亡作用，但最新研究發(fā)現(xiàn)，Daxx在T細(xì)胞存活中發(fā)揮了新的作用，但在Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中是不必要的[4]；另外，Daxx可作為細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)子與細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)相互作用，通過JNK和p38途徑啟動(dòng)凋亡；也可以和前列腺細(xì)胞凋亡反應(yīng)蛋白4(PAR-4)通過ZIP激酶的磷酸化來誘導(dǎo)凋亡[5]。而當(dāng)Daxx定位于細(xì)胞核時(shí)，它可以抑制諸如ETS143、Pax342、NF-κB、E2F120、p53和p73等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[6]，進(jìn)而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，另有研究發(fā)現(xiàn)Daxx可發(fā)揮潛在的抗細(xì)胞凋亡的功能[7]。

Daxx與多種腫瘤如胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、卵巢癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。NETSAWANG等[9]在研究登革病毒衣殼蛋白(DENVC)的過程發(fā)現(xiàn)，Daxx 能夠與核內(nèi)定位的 DENVC共同誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌HepG2 細(xì)胞的凋亡，其高表達(dá)能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，該凋亡與過氧化氫相關(guān)。Daxx能特異的結(jié)合于原癌基因c-met啟動(dòng)子區(qū)域，同時(shí)有HDAC2水平的升高，可見HDAC2參與Daxx對(duì)c-met啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌中，Daxx與c-met表達(dá)成負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說明Daxx對(duì)c-met的轉(zhuǎn)錄有一定的抑制作用[10]，而c-met基因過表達(dá)是肝細(xì)胞癌手術(shù)切除患者復(fù)發(fā)和生存的不良預(yù)后因素[11]，由此可以推斷Daxx可能與肝細(xì)胞癌的預(yù)后相關(guān)。

另一方面，Daxx在病毒的防御及抑制轉(zhuǎn)錄等方面也發(fā)揮了巨大的作用。近年研究顯示，Daxx可與多種細(xì)胞因子及病毒蛋白相互作用，共同參與調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制周期，而一些病毒蛋白的合成或病毒的感染又可反過來影響 Daxx 在細(xì)胞內(nèi)的定位，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，ZIP激酶可與Daxx共定位，與PML一起維持PML-NBs結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，該穩(wěn)定不利于病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄[13]。另外Daxx也參與了HSV-1 ICP27對(duì)NF-κB活性的抑制[14]。

本研究顯示，Daxx蛋白主要表達(dá)于正常肝組織、肝炎組織及肝硬化組織的細(xì)胞核，肝細(xì)胞癌組織的細(xì)胞質(zhì)，并且與患者的AFP、肝炎史、肝硬化史、腫瘤分化程度、TNM分期、門靜脈癌栓及Ki67表達(dá)有關(guān)，由此推測Daxx蛋白可能與肝炎病毒相互作用，而病毒的感染影響了該蛋白在細(xì)胞中的定位，導(dǎo)致其由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的作用。進(jìn)一步分析Daxx在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果表明Daxx是影響肝細(xì)胞癌預(yù)后的因素之一。

綜上所述，Daxx的高表達(dá)有可能抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移，可作為判斷肝細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立因子，具體的作用機(jī)制及其與肝炎病毒的關(guān)系有待于進(jìn)一步的研究和探索。