金大玉 印有亮

1 遼寧省遼陽(yáng)市中心醫(yī)院耳鼻喉科(遼陽(yáng) 111000)

由于頭部腫瘤的放療可導(dǎo)致耳蝸受損，甚至使部分患者放療后聽(tīng)力喪失，因此，積極尋找能夠減輕耳蝸輻射損傷的藥物是一項(xiàng)重要的課題。山莨菪堿作為毒蕈堿型(M型)乙酰膽堿受體競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑應(yīng)用于臨床，可通過(guò)多途經(jīng)調(diào)節(jié)微循環(huán)和發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，但是山莨菪堿在治療內(nèi)耳疾病方面的研究不多，僅有一些關(guān)于噪聲性聾[1、2]、梅尼埃病和突發(fā)性聾等疾病的臨床應(yīng)用報(bào)道，對(duì)耳蝸輻射損傷的保護(hù)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文旨在通過(guò)觀察豚鼠耳顳部放射后耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)和功能變化，及耳蝸放射前應(yīng)用及山莨菪堿對(duì)耳蝸放射損傷的保護(hù)作用，初步探討其機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 采用耳廓反應(yīng)靈敏的雄性黑目雜色健康豚鼠25只，體重300～400克，隨機(jī)分成3組：①正常對(duì)照組：5只，不進(jìn)行照射，觀察雙耳共10耳；②單純放射組(單放組)：10只，觀察左耳共10耳；③山莨菪堿防護(hù)組(防護(hù)組)：10只，觀察左耳共10耳。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1電離輻射方法 單放組和防護(hù)組豚鼠不麻醉，用熱塑面膜固定，專用x線模擬定位機(jī)定位；暴露頭部，用醫(yī)用直線加速器所產(chǎn)生的6 MeV電子線進(jìn)行分次照射，每次2 Gy,每周5次，共30次，累計(jì)劑量60 Gy。在每次照射前30分鐘，對(duì)防護(hù)組的豚鼠按20 mg/kg股部肌肉注射山莨菪堿，對(duì)照組和單放組注射等量生理鹽水。

1.2.2聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值檢測(cè) 各組豚鼠分別于放射前及放射完成后第二天進(jìn)行ABR閾值檢測(cè)，以剛能分辨出ABR波Ⅲ的刺激強(qiáng)度確定閾值，并至少重復(fù)2次，取平均值作為閾值。

1.2.3耳蝸基底膜鋪片及外毛細(xì)胞記數(shù) 各組隨機(jī)選擇6耳，應(yīng)用改良全耳蝸基底膜硬鋪片技術(shù)[3]及四唑氮藍(lán)(nitrotetrazolium blue tetrazolium，NBT)染色，在解剖顯微鏡下，將基底膜分離出來(lái)并置于載玻片上，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并對(duì)每個(gè)標(biāo)本連續(xù)框取20個(gè)視野，逐一進(jìn)行外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值作為每一個(gè)標(biāo)本的外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)值。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量資料均通過(guò)SPSS12.0for windows統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組照射前后ABR閾值比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，各組間外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)比較采用方差分析中的SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05代表具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1一般狀況觀察 在放射中及放射后各組豚鼠均無(wú)頭部偏斜及行走時(shí)傾倒趨勢(shì)，飲食可，無(wú)明顯消瘦，無(wú)死亡。

2.2各組豚鼠實(shí)驗(yàn)前后平均ABR閾值

表1 各組豚鼠實(shí)驗(yàn)前后平均ABR閾值比較(dB peSPL，±s)(n=10耳)

注：★與同組放射前比較，P<0.05；■放射后單放組與正常對(duì)照組比較P<0.05；▲放射后防護(hù)組與單放組比較，P<0.05

由表1可見(jiàn)，與放射前相比，放射后單放組和防護(hù)組平均ABR閾值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明放射可引起豚鼠聽(tīng)功能損害；放射后單放組的ABR平均閾值較防護(hù)組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明山莨菪堿對(duì)放射所致的耳蝸聽(tīng)功能損傷有一定程度的保護(hù)作用。

2.3耳蝸基底膜鋪片高倍鏡觀察 正常對(duì)照組內(nèi)外毛細(xì)胞排列均整齊(圖1)。單放組照射耳耳蝸的外毛細(xì)胞境界模糊不清，排列非常紊亂，外毛細(xì)胞有大量缺失；內(nèi)毛細(xì)胞的排列略紊亂，有少許缺失(圖2)。防護(hù)組照射耳耳蝸的外毛細(xì)胞境界較清晰，排列略紊亂，外毛細(xì)胞有少許缺失；內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊，缺失不明顯(圖3)。

2.4耳蝸基底膜鋪片外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 對(duì)照組、單放組及防護(hù)組外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為：162.95±5.969、54.75±7.718、144.50±7.302個(gè)/視野，可見(jiàn)，放射后放射組和防護(hù)組外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)均較對(duì)照組減少(P<0.05),但防護(hù)組外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)較放射組多(P<0.05)。

圖1 正常對(duì)照組耳蝸基底膜鋪片(×400倍) 內(nèi)外毛細(xì)胞排列均整齊圖2 單放組耳蝸基底膜鋪片(×400倍) 外毛細(xì)胞境界模糊不清,排列非常紊亂,有大量缺如圖3 防護(hù)組耳蝸基底膜鋪片(×400倍) 內(nèi)毛細(xì)胞的排列略紊亂,有少許缺如

3 討論

山莨菪堿作為M型乙酰膽堿受體競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑應(yīng)用于臨床，其作用機(jī)制主要為：①通過(guò)各種途徑調(diào)節(jié)微循環(huán)；②通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)游離鈣升高避免鈣超載發(fā)生[3，4]和抗氧化作用[5]減少自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，而實(shí)現(xiàn)保護(hù)細(xì)胞作用。

在本研究中，單放組放射后ABR平均閾值為52.27±2.42 dB peSPL；防護(hù)組放射結(jié)束后為37.65±1.92 dB peSPL，放射后單放組的ABR平均閾值較防護(hù)組增高，表明山莨菪堿對(duì)放射所致的耳蝸聽(tīng)功能損傷具有一定程度的保護(hù)作用。光鏡觀察，單放組耳蝸的外毛細(xì)胞境界模糊不清，排列非常紊亂，外毛細(xì)胞有大量缺失，內(nèi)毛細(xì)胞的排列略紊亂，有少許缺失；防護(hù)組耳蝸的外毛細(xì)胞境界較清晰，排列略紊亂，外毛細(xì)胞有少許缺失；內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊，缺失不明顯；放射后，單純放療組的耳蝸基底膜鋪片外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值較防護(hù)組明顯減少，說(shuō)明山莨菪堿對(duì)耳蝸毛細(xì)胞有一定程度的保護(hù)作用，與ABR閾值檢測(cè)結(jié)果一致。

山莨菪堿對(duì)耳蝸輻射損傷防護(hù)作用的機(jī)制可能與其通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)內(nèi)耳微循環(huán)和其細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。對(duì)山莨菪堿抗氧化機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，它對(duì)次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基有顯著的劑量依賴性清除作用[6]，因此，可通過(guò)抗氧化作用減少自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)僅初步探討了山莨菪堿對(duì)豚鼠耳蝸輻射損傷的保護(hù)作用，但關(guān)于山莨菪堿的不同劑量與其耳蝸輻射損傷保護(hù)作用的關(guān)系等有望在以后的研究中進(jìn)一步完善。