謝利紅 王夢琳 唐安洲

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧 530021)

噪聲暴露、環(huán)境因素、藥物毒性或年齡老化等均可導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞損傷，并繼發(fā)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，成年哺乳動物毛細(xì)胞損傷后無自發(fā)再生能力可導(dǎo)致永久性的感音神經(jīng)性聾[1～3]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對于激活內(nèi)耳相關(guān)通路、誘導(dǎo)內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞(部分具有增殖能力的支持細(xì)胞亦稱感覺前體細(xì)胞)或干細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，增殖、分化為毛細(xì)胞，使聽力或前庭功能恢復(fù)的研究成為熱點[4]，毛細(xì)胞再生有望成為聽力恢復(fù)的理想治療方法。本文就內(nèi)耳毛細(xì)再生及其信號通路等研究進(jìn)行綜述。

1 哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的現(xiàn)狀

在胚胎發(fā)育的早期，外胚層增厚形成耳板，耳板內(nèi)陷后逐漸形成聽覺和前庭系統(tǒng)[5, 6]。在內(nèi)耳的發(fā)育形成過程中毛細(xì)胞與支持細(xì)胞擁有共同的祖細(xì)胞。在非哺乳脊椎動物中(如鳥類和禽類)毛細(xì)胞損傷后可由其鄰近的支持細(xì)胞通過有絲分裂增殖、分化為新的毛細(xì)胞而恢復(fù)聽力[7]。與非哺乳脊椎動物不同，成年哺乳動物的毛細(xì)胞損傷缺失后不能自發(fā)產(chǎn)生新的毛細(xì)胞，從而導(dǎo)致永久性聽力障礙。通過體外誘導(dǎo)新生哺乳動物的內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞、干細(xì)胞，可以將其分化為毛細(xì)胞樣細(xì)胞；研究人員分別從耳蝸Corti器、大上皮脊(GER)、小上皮脊(LER) 前庭球囊和橢圓囊感覺上皮[8～10]、三個半規(guī)管的壺腹脊等不同組織中均分離得到了內(nèi)耳干細(xì)胞[11]。

Li等[10]將內(nèi)耳干細(xì)胞接種在多聚賴氨酸預(yù)先處理好的培養(yǎng)皿中，貼壁無血清培養(yǎng)，14天之后基因檢測表明分化之后的細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物MyosinⅦ和Bm3c。Oshiima等[11]對分化后的毛細(xì)胞進(jìn)行電生理檢測，顯示該細(xì)胞可產(chǎn)生電壓依賴性電流。Li等[10]研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳干細(xì)胞在體外具有分化為毛細(xì)胞之外的多分化潛能。

在新生哺乳動物耳蝸Corti器中分離出感覺前體細(xì)胞，如：少量Lgr5+Axin2+前體細(xì)胞具有有限的毛細(xì)胞再生能力[12, 13]。Oshima等[11]通過培養(yǎng)新生小鼠 Corti器中的干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其可分化成為具有多種毛細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞，但是在小鼠出生2～3周后耳蝸中的干細(xì)胞數(shù)量明顯減少。氨基糖苷類藥物損傷體外培養(yǎng)新生鼠的毛細(xì)胞后，通過誘導(dǎo)部分干細(xì)胞可分化成為未成熟毛細(xì)胞[14]。新生毛細(xì)胞主要位于內(nèi)生毛細(xì)胞周圍，基底膜外側(cè)出現(xiàn)Tuj1(+) 標(biāo)記神經(jīng)再支配[15]。成年哺乳動物毛細(xì)胞損傷后不能自發(fā)產(chǎn)生新的毛細(xì)胞，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳受損區(qū)旁的毛細(xì)胞、支持細(xì)胞、多能干細(xì)胞等在一定條件誘導(dǎo)下可能是毛細(xì)胞再生的來源，Walters等[16]在敲除p27Kip1基因的噪聲性聾模型成年鼠中，發(fā)現(xiàn)異位Aloh1的表達(dá)增加，受損毛細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞可以產(chǎn)生新的毛細(xì)胞。White等[17]研究顯示，氨基糖苷類藥物損傷成熟哺乳動物毛細(xì)胞后，通過體外培養(yǎng)內(nèi)耳感覺上皮，發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化為未成熟毛細(xì)胞的潛能。

2 內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的信號調(diào)控機(jī)制

近年來，在對雞、斑馬魚或鼠等動物毛細(xì)胞再生的研究后認(rèn)為，部分支持細(xì)胞具有感覺前體細(xì)胞作用，能被誘導(dǎo)增殖并分化為毛細(xì)胞，其分化再生為毛細(xì)胞主要通過兩種途徑：一種是感覺前體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)激活后重新進(jìn)入細(xì)胞周期，通過有絲分裂增殖、進(jìn)一步分化成為毛細(xì)胞及支持細(xì)胞; 另一種則是通過直接分化的途徑而再生成為毛細(xì)胞[18]。感覺前體細(xì)胞的增殖和分化過程受各種相關(guān)的信號通路調(diào)控，近年來研究比較多的通路包括Wnt信號通路、Noth信號通路、BMP/Smad、FGF、IGF和Shh信號通路等[6, 19～21]。這些信號通路在胚胎時期毛細(xì)胞發(fā)育和分化形成的多個環(huán)節(jié)中起重要調(diào)控作用，可對一些細(xì)胞周期調(diào)控因子進(jìn)行調(diào)控。而在成年哺乳動物內(nèi)耳中這些信號通路會出現(xiàn)改變，此可能是使毛細(xì)胞損傷后無再生能力的重要原因。目前研究最多的是Notch信號通路及Wnt信號通路，兩者均是復(fù)雜和高度保守的信號通路，在內(nèi)耳細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞極性、神經(jīng)形成和干細(xì)胞的多態(tài)性中起作用。

2.1Wnt信號通路在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中的調(diào)控作用 Wnt信號通路包括經(jīng)典Wnt /β-catenin通路和非經(jīng)典Wnt 信號通路，其中非經(jīng)典Wnt 信號通路主要包括：Wnt/平面細(xì)胞極性通路、Wnt/PCP信號通路和Wnt/calcium信號通路[12, 22, 23]。

經(jīng)典Wnt /β-catenin通路包括Wnt配體與細(xì)胞膜表面的Frizzled受體和LRP5 / 6受體的耦合，激活Dash蛋白導(dǎo)致Axin2/ GSK3β/ APC復(fù)合體的解體，β-catenin 蛋白的釋放進(jìn)入細(xì)核內(nèi)，與T細(xì)胞因子(T cell factor / lymphoid enhancerfactor, TCF/LEF)相互作用(圖1)，調(diào)節(jié)靶基因(如Atoh1、Axin2、Lgr5等)的表達(dá)。在Wnt 信號沒有激活時，β-catenin 在內(nèi)耳細(xì)胞內(nèi)維持很低的水平，當(dāng)Wnt信號通路激活時，β-catenins水平增加。Wnt/β-catenin抑制劑可以減少胚胎耳蝸感覺前體細(xì)胞的增殖，相反使用LiCl等Wnt/β-catenin活化劑可引起Sox2陽性表達(dá)的內(nèi)耳前體細(xì)胞和毛細(xì)胞數(shù)量的增加[7]。在敲除β-catenin的轉(zhuǎn)基因鼠中，前體細(xì)胞則停止分化，毛細(xì)胞數(shù)量減少，其下游的靶基因Atoh1的表達(dá)也會明顯減少。Wnt/PCP信號通路調(diào)節(jié)耳蝸再生毛細(xì)胞表面的纖毛束的形成和方向，與毛細(xì)胞的外形和Corti器的形狀有關(guān)。

Wnt/PCP信號通路參與毛細(xì)胞再生的機(jī)制目前尚未明確，其受GTP酶RhoA和Ras的調(diào)節(jié)，RhoA和Ras可激活JNK(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase，又稱為應(yīng)激活話蛋白激酶)和ROCK(Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶,Rho associated coiledeoil forming protein kinase，ROCK)，引起細(xì)胞骨架重排，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變。在Wnt/calcium 信號通路中，Wnt 配體和Fzd受體結(jié)合可引起鈣離子的釋放，促使鈣離子依賴性酶類的激活，該通路與胚胎發(fā)育階段的細(xì)胞運(yùn)動和體軸建立有關(guān)[24, 25]。

在Wnt信號通路中，與哺乳動物內(nèi)耳發(fā)育過程有關(guān)的主要有經(jīng)典Wnt/β-catenin和Wnt/PCP 信號通路，到目前為止，未發(fā)現(xiàn)Wnt/calcium 信號通路在內(nèi)耳發(fā)育過程中有明顯的作用。經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路主要在內(nèi)耳發(fā)育早期起作用，自E12.5(胚胎12.5天)起，主要參與感覺上皮區(qū)域細(xì)胞命運(yùn)的決定；Wnt/PCP 信號通路則在毛細(xì)胞靜纖毛的排列和蝸管的延伸過程中起著重要作用[26]。

2.2Notch信號通路在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中的調(diào)控作用 研究表明 Notch信號負(fù)性調(diào)節(jié)內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞的增殖，并維持耳蝸感覺上皮細(xì)胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)[20]。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不需蛋白激活和第二信使的參與,可通過細(xì)胞表面的受體，直接接收鄰近細(xì)胞的信號并傳導(dǎo)至細(xì)胞核，激活細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在哺乳類動物的聽覺感受上皮中Notch信號通路的受體主要是Notchl,配體主要為Deltal、Jagged1和Jagged2[6, 27]，當(dāng)鄰近細(xì)胞表面的配體結(jié)合Notch蛋白后，Notch信號被激活，由γ-secretase酶水解、切割Notch跨膜區(qū)，釋放Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(notch intracellular domain，NICD)，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到到細(xì)胞核中，與CSL家族(CBF1、SuH、Lagl)轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，誘導(dǎo)一系列基因的轉(zhuǎn)錄(圖2)。Notch信號中Jagged 1的缺失會導(dǎo)致Sox2 and P27kip1陽性的感覺前體細(xì)胞減少，從而引起毛細(xì)胞數(shù)量的減少[6]。

圖1 經(jīng)典Wnt信號通路示意圖(圖片摘自Chai R. et al.[12])

Notch信號通路在內(nèi)耳中具有橫向誘導(dǎo)和橫向抑制的作用，橫向誘導(dǎo)是在相鄰感覺前體細(xì)胞Notch信號受體和配體形成中正反饋環(huán)路。在毛細(xì)胞和支持細(xì)胞分化的早期橫向誘導(dǎo)起主要作用，而在毛細(xì)胞和支持細(xì)胞分化晚期則是橫向抑制起主要作用[27]。成年鼠中Notch信號能抑制感覺前體細(xì)胞分化為毛細(xì)胞，但是在內(nèi)耳損傷后，該信號通路可再次被激活而具有促進(jìn)毛細(xì)胞再生的潛在能力；如：在噪聲引起毛細(xì)胞損傷的動物模型中，γ-分泌抑制劑(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨酰基-L-2苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)能抑制Notch信號通路引起Atoh1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而觸發(fā)毛細(xì)胞的再生；在成年鼠中，耳毒性藥物耳蝸損傷后可引起Notch信號通路的活化[28～30]。

Wnt信號通路可以正向調(diào)節(jié)Notch信號通路中Jagged1、 Notch1和Hes1的表達(dá)[10, 31]。Wnt信號和Notch信號通路在耳蝸發(fā)育中相互影響激活Wnt信號通路，聯(lián)合使用γ-分泌抑制劑DAPT能誘導(dǎo)耳蝸感覺前體細(xì)胞分化成毛細(xì)胞。Wnt和Notch信號在耳蝸發(fā)育中的相互影響的具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究[32]。

圖2 Notch信號通路在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中的調(diào)控機(jī)制(圖片摘自Waqas Muhammad, et al[6])

2.3與內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的細(xì)胞因子 細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在哺乳動物內(nèi)耳發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，主要與內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖并分化為毛細(xì)胞的調(diào)控過程有關(guān)。這些細(xì)胞周期調(diào)控因子包括正性調(diào)控因子和抑制因子，兩者相互協(xié)調(diào)共同調(diào)控毛細(xì)胞的產(chǎn)生、分化和成熟。細(xì)胞周期正性調(diào)控因子有cyclinD1、cyclinA2、Skp2，細(xì)胞周期抑制因子包括：Rb的上游分子(如：p27Kip1、p57Kip2、p19Ink4d和p21Cip1)；Rb蛋白(如：Rb、p107和p130)；Rb下游分子(如：E2Fs)[33, 34]；其中Rb蛋白在促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞退出細(xì)胞周期方面起到關(guān)鍵作用[35]。在鼠E13.5的ZNPC區(qū)域，前體細(xì)胞可分化成毛細(xì)胞或支持細(xì)胞[36]，而在Rb基因敲除的野生型胚胎鼠中，E10.5的ZNPC區(qū)域(zone of nonproliferating cells非增殖區(qū)域)仍包含BrdU(+)的細(xì)胞，前體細(xì)胞池增殖擴(kuò)大，內(nèi)耳前體細(xì)胞不能退出細(xì)胞周期，進(jìn)一步分化成多余的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞[33，35, 36]。另外，Rb蛋白可直接或間接參與細(xì)胞分化期間基因表達(dá)的調(diào)控，R6基因是保持毛細(xì)胞有絲分裂后狀態(tài)的關(guān)鍵因子。目前為止，對于調(diào)控P27轉(zhuǎn)錄的上游分子尚不清楚，可能與Notch1、Sox2和Jag1的調(diào)控有關(guān)[37]。

3 結(jié)語

綜上所述，在內(nèi)耳發(fā)育的過程中，Wnt、Notch信號等通路及與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的細(xì)胞因子在調(diào)控支持細(xì)胞和毛細(xì)胞的分化和發(fā)育過程中起到非常重要的作用。雖然內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞在體外可以誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞，但是新生的毛細(xì)胞是否具有體內(nèi)毛細(xì)胞的功能和特性還需要進(jìn)一步的研究。Zhang[8]和Zhai等[38]分別從新生小鼠LER和GER區(qū)域分離得到內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞，并將其與橢圓囊間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)可以明顯提高內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的比例。內(nèi)耳干細(xì)胞所處的微環(huán)境以及與鄰近細(xì)胞的相互作用對于內(nèi)耳干細(xì)胞、感覺前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的內(nèi)耳毛細(xì)胞至關(guān)重要。但是到目前內(nèi)為止，內(nèi)耳干細(xì)胞、感覺前體細(xì)胞分化為毛細(xì)胞的效率較低。因此，未來的研究應(yīng)該致力于建立高效安全的誘導(dǎo)體系，誘導(dǎo)形成成熟并具有功能的毛細(xì)胞。此外各信號通路及細(xì)胞調(diào)控因子之間是如何進(jìn)行分工及精確調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系還需要進(jìn)一步的深入研究。