王燚霈 朱 瑩△ 高 昂

（1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.湖南省長沙市望城區(qū)人民醫(yī)院，湖南 長沙 410200）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種以結(jié)腸黏膜及黏膜下層連續(xù)彌漫的潰瘍及糜爛為特點的慢性非特異性炎癥性腸病，病情易反復，難以治愈，病變持續(xù)時間較長，有一定的癌變率［1］，是目前世界公認的難治性疾病。腸道免疫功能紊亂是UC的重要病因。目前研究證明Th17/Treg平衡是腸道免疫功能動態(tài)平衡的重要組成部分，其失衡是UC的發(fā)病的關(guān)鍵要素［2］。潰結(jié)寧膏是本課題組負責人總結(jié)治療UC（脾腎陽虛證）經(jīng)驗而創(chuàng)制的，療效確切［3-5］。為明確其治療UC的作用機制，筆者選取UC（脾腎陽虛證）大鼠為觀察對象，研究潰結(jié)寧膏穴位敷貼對Th17/Treg平衡的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。動物合格證號：SCXK（湘）2011-0003，SPF實驗室許可證編號：SYCK（湘）2013-0005。標準飼料喂養(yǎng)，自由飲用三級過濾純凈水，飼養(yǎng)環(huán)境為多層層流架，恒溫20～26℃，濕度控制在40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：潰結(jié)寧膏由炮附片、細辛、丁香、芥子、赤芍、延胡索、生姜等組成，由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科提供并制成巴布劑；番瀉葉，本院藥劑科提供；無藥物巴布劑基質(zhì)由聚丙烯酸鈉、明膠、高嶺土、甘羥鋁、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇制成，本院藥劑科提供；柳氮磺胺吡啶片，0.25 g/片，上海三維制藥有限公司，批號：20120615。 2）試劑及儀器：2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS），美國 Sigma 公司，批號：107K5008；腺嘌呤（Adenine）（購自上海博景化工有限公司），加蒸餾水配置為20g/L混懸液；Foxp3 ELISA試劑盒、IL-17 ELISA試劑盒，武漢基因美生物科技有限公司；臺式冷凍離心機，湘儀 TGL-16；全自動酶標洗板機，匯松PW-812；酶標儀，匯松MB-530；電熱恒溫干燥箱，光都DHG-900Z-0；電子天平，江蘇省武進市衡器廠RTZ-IOA-RT；S2-93自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；AO切片機，LEICA公司RM2235；光學顯微鏡，OLYMPUS公司BX50。

1.3 分組與造模 健康的SPF級SD雄鼠40只被毛染色法編號、稱體質(zhì)量，按照隨機數(shù)字表法將40只大鼠分為正常對照組、潰瘍性結(jié)腸炎（脾腎陽虛證）模型組（模型組）、潰結(jié)寧膏穴位敷貼治療組（敷貼組）、柳氮磺吡啶治療組（SASP組），每組均為10只。模型組、敷貼組及SASP組大鼠進行動物模型制備。UC（脾腎陽虛證）大鼠模型建立方法參考課題組前期研究［6］。每天上午定時定點，大鼠予腺嘌呤按10 mL/kg劑量灌胃，連續(xù)2周，從第3周起開始每日予冰番瀉葉按10 mL/kg灌胃，連續(xù)2周，造模周期共4周，造模期間自由飲食；每日灌胃0.5 h后用噴霧器給每只大鼠均勻噴4℃冰水50 mL，濕潤皮毛，然后將大鼠置于電風扇前（1400 r/min）吹干處置，連續(xù)4周后于第29天禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，將聚丙烯管插入大鼠肛門上段8 cm處，注入5%TNBS按100 mg/kg（約TNBS原液0.2 mL/100 g）加50%乙醇0.25 mL制成的混合試劑，然后提起大鼠尾部，保持倒置1～2 min，使試劑充分完全在大鼠腸腔滲透，然后將大鼠輕放置于籠子，待其自然清醒，自由飲食飲水。正常對照組大鼠則同期予相應劑量的0.9%氯化鈉注射液灌胃和灌腸處理。

1.4 干預方法 所有大鼠均選取以下穴位：中脘、氣海、足三里（雙側(cè)）、天樞（雙側(cè)）。各穴定位參考郭義主編《實驗針灸學實驗指導》［7］及《大鼠穴位圖譜的研制》［8］。中脘：臍上約20 mm左右。氣海：臍下約12 mm左右。足三里：在膝關(guān)節(jié)下側(cè)，腓骨小頭下緣5 mm處，左右兩側(cè)各一穴。天樞：在臍旁0.5 cm，左右兩側(cè)各一穴。敷貼位置先用剪刀將毛剪短，再用剃毛器將毛剃凈，每次剃毛4 cm2大小，貼藥至穴位處后予鼠夾固定。1）正常對照組：將無藥物的巴布劑基質(zhì)穴位敷貼，0.9%氯化鈉注射液［5 mL/（kg·d）］灌胃。 2）模型組：處理同正常對照組。3）敷貼組：潰結(jié)寧膏穴位敷貼，0.9%氯化鈉注射液［5 mL/（kg·d）］灌胃。 4）SASP 組：無藥物的巴布劑基質(zhì)穴位敷貼，柳氮磺胺吡啶溶液（用0.9%氯化鈉注射液配成10 mg/mL的溶液）50 mg/kg劑量灌胃。各組于造模結(jié)束后1周開始給藥，每日1次，敷貼時間每次1～1.5 h。足三里、天樞每次貼一側(cè)，左右交替，給藥療程均為28 d。

1.5 標本采集與檢測 1）一般情況觀察。實驗期間每天檢測并記錄各組大鼠體質(zhì)量、飲食飲水量及肛溫作量化指標，觀察各組大鼠大便性狀、大便次數(shù)和血便程度及背毛光澤程度、活動度、精神狀態(tài)及活動等一般狀況。2）疾病活動指數(shù)（DAI）評分。實驗期間觀察大鼠體質(zhì)量、大便性狀、血便情況，按DAI評分標準［9］進行評分，即DAI=（體質(zhì)量下降指數(shù)+大便性狀+出血情況）÷3。3）結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）。治療28 d后大鼠禁食12 h，以10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，剪開腹壁，快速取結(jié)腸組織，肉眼觀察結(jié)腸病變組織腸黏膜形態(tài)，以正常、糜爛、潰瘍分級描述，進行結(jié)腸黏膜大體形態(tài)損傷指數(shù)評分［10］。4）結(jié)腸組織病理學及組織學損傷指數(shù)（TDI）。大鼠脊椎脫臼法處死后，取約1 cm結(jié)腸腸段用4%多聚甲醛固定，組織脫水，石蠟包埋，切片機切片，進行常規(guī)HE染色，使用光學顯微鏡觀察結(jié)腸組織病理變化，進行結(jié)腸組織學損傷評分［11］。5）血清及結(jié)腸中IL-17、Foxp3水平的測定。取1段長約0.5 cm的結(jié)腸組織，冰生理鹽水清洗，置于EP管中，采用ELISA法進行測定，嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性分布及方差齊性檢驗，符合者，組間比較采用單因素方差分析，不符合者采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況觀察 正常對照組大鼠在整個實驗過程中未出現(xiàn)明顯的變化，大小便、活動度、精神、飲食飲水量均正常。造模過程中模型組、敷貼組及SASP組大鼠逐漸出現(xiàn)大便溏泄，體毛逐漸枯槁失去光澤，喜扎堆，活動度減少，精神欠佳，頻繁瞇眼，飲食及飲水量逐漸減少，與正常對照組比較體質(zhì)量增長緩慢，小便次數(shù)增多；造模結(jié)束后上述3組大鼠解黏液便，大便隱血陽性，肛門周圍沾有污物，拱背蜷縮，喜集聚，體毛枯槁稀疏，精神萎頓，小便清長，飲食及飲水量明顯降低，體質(zhì)量增長幅度較正常組大鼠明顯減小，部分甚至出現(xiàn)腹部脹滿。經(jīng)過28 d治療后SASP組、敷貼組大鼠黏液膿血便、神態(tài)萎頓、嗜睡懶動，拱背蜷縮聚堆等癥狀基本消失，飲食及飲水接近正常對照組，動作較前靈敏，精神好轉(zhuǎn)；模型組大鼠持續(xù)解黏液大便，偶可見鮮紅色血便，精神持續(xù)變差，少氣懶動，體毛枯槁脫落，小便量及次數(shù)多，飲食及飲水量進一步減少，體質(zhì)量較前繼續(xù)下降。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、飲水及肛溫量化比較 見表1。治療前，與正常對照組對比，模型組、敷貼組及SASP組各組大鼠體質(zhì)量下降，飲水量明顯減少，肛溫降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），說明脾腎陽虛UC體質(zhì)量下降，飲水量減少，肛溫降低。治療后，與正常對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量下降，飲水量下降，肛溫降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明疾病持續(xù)進展，無明顯緩解；與模型組比較，敷貼組、SASP組大鼠體質(zhì)量、飲水量增加，肛溫升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示敷貼、SASP 治療有效；SASP 組與敷貼組體質(zhì)量、飲水量、肛溫相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。正常對照組、模型組治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。敷貼組及SASP組治療后較治療前體質(zhì)量、飲水量增加，肛溫升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、飲水量及肛溫比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、飲水量及肛溫比較（±s）

與本組治療前比較，▼P＜0.05；與模型組治療后比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與敷貼組治療后比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01

體質(zhì)量（g） 飲水量（mL） 肛溫（℃）385.10±25.70▲▲▽▽ 202.50±21.70▲▲▽▽ 37.80±0.16▲▽396.70±26.20▲▲▽ 210.50±22.70▲▲▽ 37.80±0.18▲▲296.40±23.50 120.60±15.50 36.70±0.17（n＝9） 治療后 276.40±16.50▽ 111.60±14.30▽ 36.50±0.16▽敷貼組 治療前 300.30±21.50 115.40±16.30 36.80±0.20（n＝9） 治療后 365.30±22.50▲▼ 188.50±17.80▲▼ 37.60±0.20▲▼SASP 組 治療前 299.50±20.40 120.40±15.30 37.00±0.19（n＝9） 治療后 370.50±23.20▲▼ 190.80±16.10▲▼ 37.50±0.18▲▼組 別 時間正常對照組 治療前（n＝10） 治療后模型組 治療前

2.3 各組大鼠DAI、CMDI、TDI比較 見表2。與正常對照組相比，各組大鼠DAI、CMDI及TDI均增高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組相比較，敷貼組及SASP組DAI、CMDI及TDI均顯著降低（P＜0.01），但敷貼組、SASP兩組間各積分比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠疾病活動指數(shù)、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)、結(jié)腸組織損傷評分比較（分，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。下同

組 別 n TDI DAI CMDI正常對照組 10 0.82±0.42模型組 9 5.84±1.48**敷貼組 9 2.12±1.06*▲▲0.09±0.18 0.72±0.37 3.00±0.37** 4.61±0.98**1.01±0.29*▲▲ 1.84±0.78*▲▲SASP 組 9 1.87±1.23*▲▲0.91±0.21*▲▲ 1.66±0.74*▲▲

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織病理觀察 見圖1。正常對照組：上皮完整，各層結(jié)構(gòu)清晰。模型組：黏膜缺損并且壞死脫落，可見潰瘍灶形成，嚴重者深達黏膜下層，伴中性粒細胞等大量炎性細胞浸潤。敷貼組：黏膜缺損較少，黏膜及黏膜下炎性細胞浸潤少，腺體結(jié)構(gòu)改善。SASP組：黏膜下毛細血管充血，黏膜下層稍有水腫，少量炎性細胞浸潤。

2.5 各組大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-17和血清中Foxp3水平比較 見表3。與正常對照組比較，模型組、敷貼組、SASP組大鼠血清及結(jié)腸中IL-17水平均明顯升高、血清Foxp3水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，敷貼組及SASP組大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-17水平明顯降低、血清Foxp3水平明顯增高（P＜0.01），但敷貼組與SASP組表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 大鼠結(jié)腸組織病理觀察（HE染色，100倍）

表3 各組大鼠血清及結(jié)腸組織IL-17、血清Foxp3比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清及結(jié)腸組織IL-17、血清Foxp3比較（pg/mL，±s）

組 別 n 血清Foxp3血清IL-17 結(jié)腸IL-17正常對照組 10 4650.41±14.00模型組 9 2706.35±6.68**敷貼組 9 3439.17±17.50*▲▲124.09±1.65 93.39±1.76 242.44±10.49**190.83±1.94**174.77±1.61*▲▲ 153.39±2.00*▲▲SASP 組 9 3464.68±12.47*▲▲170.35±4.39*▲▲ 149.00±1.87*▲▲

3 討 論

UC的發(fā)病機制復雜，涉及環(huán)境和遺傳因素。UC被認為是由于上皮屏障功能受損、腸道菌群失調(diào)和異常免疫反應的結(jié)果［12］。當前，國內(nèi)外學者普遍認為腸道免疫在UC的發(fā)病中扮演了重要角色［13］。正常狀態(tài)下，腸黏膜免疫細胞自發(fā)分泌抗炎因子與促炎因子，并保持動態(tài)平衡，以維持腸道的正常免疫，當機體受到刺激時，該平衡被打破，炎性因子的分泌失衡，抗炎因子降低，促炎因子升高，導致腸黏膜免疫失衡［14］。Th17與Treg是一對具有相互拮抗作用的T淋巴細胞，維持著腸道免疫穩(wěn)態(tài)平衡，當腸道出現(xiàn)異常時常表現(xiàn)出Th17/Treg失衡，引起一系列炎癥反應損傷腸道組織。Th17 細胞主要分泌 IL-17、IL-6、IL-21、IL-22、TNF-α等細胞因子，在UC中起促炎性作用［15］。Treg細胞主要以表達轉(zhuǎn)錄因子Foxp3為特征，它具有免疫抑制功能，能控制腸道炎癥。近年來有研究表明Th17/Treg平衡向Th17方向傾斜時UC發(fā)生發(fā)展，當Th17/Treg平衡像Treg方向傾斜時，UC可緩解。

中醫(yī)學潰瘍性結(jié)腸炎可歸屬于 “痢疾”“泄瀉”“腸癖”“大瘕泄”等范疇。本文第2作者朱瑩在近10年的前期研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)UC患者表現(xiàn)為脾腎陽虛的癥狀為主，實為病延日久，損傷腎陽，腎陽不足，命門火衰，不能溫煦脾土，陽氣不能溫煦，血行不暢，又“久病必瘀”，而導致氣血瘀滯，故提出UC的病機以“脾腎陽虛挾瘀”為主，并本著“治病求其本”的原則，創(chuàng)制出潰結(jié)寧膏，方中以炮附子、細辛、丁香、延胡索、赤芍、生姜、白芥子等作為主要成分，選取敷貼穴位：胃經(jīng)的募穴“中脘”、大腸經(jīng)的下合穴“足三里”及募穴“天樞”、補腎固元的“氣海”?，F(xiàn)代腧穴學研究表明，足三里、氣海能增強機體免疫力，與天樞、足三里相配能改善腸道微循環(huán)，從而消除炎癥，修復損傷的腸黏膜屏障。潰結(jié)寧膏經(jīng)皮膚、穴位持續(xù)作用于全身，達到對UC的治療作用。課題組前期臨床研究證實潰結(jié)寧膏穴位貼敷治療UC具有較好的臨床療效，其機制可能與抑制自身免疫性炎癥機制相關(guān)［4-5，16，19］。

本實驗觀察到改善大鼠一般臨床表現(xiàn)方面，各組采取相應治療措施治療后，敷貼組及SASP組大鼠較模型組體質(zhì)量、飲水量增長，肛溫升高，提示潰結(jié)寧膏穴位敷貼可有效改善UC（脾腎陽虛證）大鼠臨床癥狀。腸道炎癥方面，與正常組相比，模型組DAI、CMDI、TDI均明顯增高，說明UC（脾腎陽虛證）大鼠出現(xiàn)便溏、大便隱血陽性、體質(zhì)量減輕、結(jié)腸組織出現(xiàn)糜爛甚至潰瘍，炎性細胞的浸潤十分明顯；與模型組比較，敷貼組及SASP組DAI、CMDI、TDI均顯著下降，說明潰結(jié)寧膏穴位敷貼及SASP灌胃可以改善UC（脾腎陽虛證）大鼠便血情況，加快體質(zhì)量增長，促進黏膜愈合，減少中性粒細胞的浸潤，潰結(jié)寧膏穴位敷貼可改善腸黏膜炎癥。炎性因子方面，采用ELISA對血清及結(jié)腸組織中IL-17、Foxp3表達進行檢測，與正常組對比，模型組大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-17的表達明顯增高，F(xiàn)oxp3水平明顯下降，與模型組比較，敷貼組及SASP組大鼠IL-17水平明顯降低、Foxp3水平明顯增高，說明潰結(jié)寧膏穴位敷貼及SASP灌胃可明顯降低UC（脾腎陽虛證）大鼠血清及結(jié)腸組織中炎性因子IL-17的水平，并能增高抑炎轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的水平，減少腸道炎癥反應。

綜上所述，UC（脾腎陽虛證）發(fā)病與IL-17水平增高、Foxp3水平降低呈相關(guān)性，而潰結(jié)寧膏穴位敷貼可明顯改善UC（脾腎陽虛證）大鼠一般臨床表現(xiàn)，顯著降低促炎因子IL-17表達、增高抗炎因子Foxp3表達，調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡，維持腸道黏膜免疫功能平衡，從而有效地治療UC（脾腎陽虛證）。