陳 晨 曹明明 吳 丹 呂曉琳 馮秋菊 黃樹明△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 黑龍江 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱黑龍江 150040）

無復(fù)流現(xiàn)象是急性心肌梗死再灌注治療的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，直接影響著患者的預(yù)后。有研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在對ST段抬高的急性心肌梗死患者行PCI治療后，冠狀動脈無復(fù)流的發(fā)生率高達(dá)32%［1-2］。因此，有效防治再灌注無復(fù)流的發(fā)生，能夠顯著降低患者心力衰竭和住院死亡的發(fā)生。然而本病病理機制復(fù)雜，目前尚無有效的防治無復(fù)流的方法。針灸作為一種安全、有效、便捷的治療手段，已被廣泛用急重癥的治療。大量研究證實，針刺能夠通過自噬途徑改善組織形態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞胞存活發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。本課題組前期在針刺防治缺血再灌注損傷和無復(fù)流方面均做了大量的研究，結(jié)果顯示電針預(yù)處理能夠通過調(diào)控再灌注心肌炎性因子的表達(dá)，從而減少無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生。因此本研究通過觀察心肌細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，旨在進(jìn)一步闡明電針防治急性心肌梗死無復(fù)流的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠40只，雄性，9周齡，體質(zhì)量（250±16）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證批號：SCXK（黑）2015003。飼養(yǎng)條件：室溫20～23℃，濕度45%～50%，普通飲食，自由飲水。實驗過程符合《實驗動物管理和使用指南》［3］中的相關(guān)規(guī)定。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：阿托伐他汀鈣片（立普妥，國藥準(zhǔn)字H20051408，輝瑞制藥有限公司，20 mg/片），6%硫磺素、伊文思蘭和2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色（TTC）試劑盒（美國 Sigma公司），一抗：兔抗大鼠Beclin1、LC3、p62/SQSTM1、Bcl-2、Bax 和 β-actin 多克隆抗體（萬類生物科技有限公司）。二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔IGG抗體（碧云天生物科技有限公司）。2）儀器：25 mm×40 mm針灸針 （貴州安迪藥械有限公司），SDZ-Ⅱ電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），Premium U570-80℃超低溫冰箱 （德國Eppendorf公司），DYCZ-24K電泳儀、DYCZ-24EN電泳槽 （北京六一生物科技公司）。

1.3 分組與造模 大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、電針預(yù)處理組和阿托伐他汀組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均參照韋星等［4］造模方法，大鼠20%烏拉坦腹腔注射麻醉后固定于實驗臺，氣管切開，插管連接呼吸機并調(diào)整呼吸參數(shù)。沿胸骨左緣第2肋至第4肋縱行切開，打開心包膜，剔除心底的脂肪組織后于左心耳和肺動脈圓錐出結(jié)扎冠狀動脈左前降支，假手術(shù)組不做結(jié)扎處理。結(jié)扎處理45 min后剪斷結(jié)扎線以恢復(fù)血供，根據(jù)心肌顏色的變化證實再灌注，再灌注時間為120 min。

1.4 干預(yù)方法 電針預(yù)處理組固定大鼠后，針灸針垂直刺入雙側(cè)“內(nèi)關(guān)穴”“心俞穴”和“膻中穴”分別采用斜刺法和平刺法?！皟?nèi)關(guān)穴”（雙側(cè)）“心俞穴”（雙側(cè)）及“膻中穴”（單側(cè)），參照《實驗針灸學(xué)》［5］中相關(guān)穴位的定位。進(jìn)針后行提插捻轉(zhuǎn)手法行針1 min后連接SDZ-Ⅱ電子針療儀。連接方法：同側(cè)穴位以內(nèi)關(guān)穴連接心俞穴，膻中穴在其旁開0.5 cm處另刺入一針作為輔助電極，疏密波，頻率5 Hz，強度1 mA，以上肢輕微震顫為度，每日治療1次，每次30 min，連續(xù)治療7 d。阿托伐他汀組于造模前給予阿托伐他汀鈣片15 mg/kg與2 mL 0.9%氯化鈉注射液配制成懸濁液，灌胃治療，每日1次，連續(xù)治療7 d。模型組和假手術(shù)組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃治療。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 1）樣本采集及缺血率、心肌無復(fù)流率、梗死率監(jiān)測。再灌注結(jié)束后于左心房注入0.4 mL的6%硫磺素后，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，于左心房再次注入0.4 mL的2%伊文思蘭。迅速處死大鼠后取出心臟，放入生理鹽水中沖洗心臟，放入-80℃冰箱中冷凍10 min。取出心臟，沿長軸方向?qū)⑿氖仪谐珊穸燃s為2 mm的切片，在365 nm的紫外線下觀察硫黃素染色，在普通光照下觀察伊文思蘭染色。無復(fù)流區(qū)在熒光下不顯色，復(fù)流區(qū)顯色；非缺血區(qū)心肌呈藍(lán)色，缺血區(qū)不著藍(lán)色。然后將心臟切除置于TTC中進(jìn)行染色，梗死區(qū)呈灰白色，非梗死區(qū)呈紅色。分別計算缺血率（缺血率=缺血面積÷左室室壁心肌面積），心肌無復(fù)流率（無復(fù)流率=無復(fù)流面積÷缺血面積）和梗死率 （梗死率=梗死面積÷缺血面積）。2）自噬和凋亡相關(guān)蛋白的檢測。取大鼠心室缺血區(qū)心肌組織液氮研碎，加入RIPA裂解液后均漿，13000 r/min離心15 min，BCA法檢測上清液蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1.5 h后加入相應(yīng)一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過夜，TBST清洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗 （1∶500稀釋），室溫孵育1.5 h，TBST清洗3次。ECL發(fā)光液顯色，掃描，Quantity One軟件分析，βactin作為內(nèi)參，比值結(jié)果表示蛋白相對含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，在符合正態(tài)分布的情況下，多組間的比較采用ANOVA單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠缺血和無復(fù)流范圍的比較 見表1。硫黃素染色結(jié)果顯示，除假手術(shù)組外，各組心室缺血率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；伊文思蘭及TTC染色結(jié)果顯示，電針預(yù)處理組無復(fù)流和心肌梗死面積較模型組顯著減少（P＜0.01）。

表1 各組大鼠缺血和無復(fù)流范圍比較（%，±s）

表1 各組大鼠缺血和無復(fù)流范圍比較（%，±s）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同

組 別 n 梗死率缺血率 無復(fù)流率假手術(shù)組 10 0模型組 10 40.62±4.11電針預(yù)處理組 10 19.76±3.05**0 0 49.30±3.76 21.52±4.07 47.44±5.09 11.78±2.18**阿托伐他汀組 10 26.35±3.62**50.75±4.21 18.20±2.74**

2.2 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 見表2，圖 1。 造模后，大鼠心肌組織中 Beclin1、LC3Ⅱ、p62/SQSTM1蛋白表達(dá)顯著增高，LC3Ⅰ蛋白表達(dá)顯著降低，與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；電針預(yù)處理能夠顯著降低再灌注大鼠心肌組織中Beclin1、LC3Ⅱ、p62/SQSTM1 蛋白的表達(dá)，增加 LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。此外，造模后大鼠LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值顯著增高，電針預(yù)處理能夠顯著調(diào)控心肌組織中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的比例，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠心肌組織自噬蛋白表達(dá)比較（%，±s）

表2 各組大鼠心肌組織自噬蛋白表達(dá)比較（%，±s）

組 別 n Beclin1/β-actin LC3Ⅰ/β-actin LC3Ⅱ/β-actin LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62/SQSTM1/β-actin假手術(shù)組 10模型組 10電針預(yù)處理組 10 0.85±0.09 1.14±0.22 0.40±0.10 1.78±0.39△△ 0.55±0.10△△ 1.70±0.33△△0.83±0.23** 1.35±0.47** 0.44±0.07**0.36±0.13 0.36±0.05 3.18±0.95△△ 1.17±0.12△△0.36±0.12** 0.30±0.09△△阿托伐他汀組 100.94±0.24** 1.10±0.47** 0.67±0.09**0.85±0.80** 0.45±0.07△△

圖1 各組大鼠心肌組織自噬蛋白表達(dá)的比較

2.3 各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 見表3，圖2。造模后，大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)顯著增高，與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；電針預(yù)處理能夠顯著增加再灌注大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低Bax蛋白的表達(dá)，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。此外，造模后大鼠Bcl-2/Bax比值顯著降低，電針預(yù)處理能夠顯著升高心肌組織中Bcl-2/Bax的比例，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)的比較

表3 各組大鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)比較（%，±s）

表3 各組大鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)比較（%，±s）

組 別 n Bcl-2/Bax Bcl-2/β-actin Bax/β-actin假手術(shù)組 10 1.58±0.63模型組 10 0.83±0.22△△電針預(yù)處理組 10 3.67±0.72**0.52±0.09 0.37±0.11 0.78±0.10△△ 0.99±0.25△△1.68±0.14** 0.48±0.12**阿托伐他汀組 10 2.38±0.71**1.45±0.30** 0.63±0.11**

3 結(jié) 果

無復(fù)流現(xiàn)象首次由Krug等于1966年在犬冠狀動脈實驗中觀察到，1974年Kloner等再次在犬冠狀動脈實驗?zāi)Ｐ椭杏^察到無復(fù)流現(xiàn)象的出現(xiàn)，并首次對其進(jìn)行了定義。無復(fù)流現(xiàn)象是一個多因素相互交錯的病理過程，其中遠(yuǎn)端微循環(huán)血管的機械栓塞、損傷的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的微血管痙攣、缺血心肌中性粒細(xì)胞的聚集引起的血液黏稠和炎癥介質(zhì)的組織、細(xì)胞水腫均能顯著增加急性心肌梗死后無復(fù)流現(xiàn)象的出現(xiàn)［6］。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑，主要負(fù)責(zé)降解大量蛋白和細(xì)胞器，是一種高度保守的生理機制［7-8］。自噬的過程非常復(fù)雜，缺血、缺氧、鈣濃度的增加和氧化應(yīng)激反應(yīng)均能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬的產(chǎn)生，同時自噬能減少凋亡因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在維持心肌細(xì)胞功能、功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要的作用［9-10］。趙海洋等通過研究發(fā)現(xiàn)，自噬在急性心肌梗死大鼠無復(fù)流區(qū)心肌組織中表達(dá)增強，且自噬與無復(fù)流的發(fā)展和程度密切相關(guān)［11］。Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳動物中的同源物，參與自噬體膜的形成，能夠上調(diào)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，是自噬關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一［12］。微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3（LC3）是經(jīng)典的自噬前體，LC3最先生無自噬活性成胞漿型LC3I，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成具有自噬活性的膜型LC3Ⅱ，并定位于溶酶體膜和自噬體上，能夠間接反映溶酶體和自噬體的數(shù)量［13］。研究證實自噬發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)的LC3Ⅰ表達(dá)下降，LC3Ⅱ表達(dá)及 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值迅速增加［14-15］。p62/SQSTM1作為一種支架蛋白，能夠通過C端的泛素結(jié)構(gòu)域與LC3相互結(jié)合，將募集的分子的聚集于自噬體，并與溶酶體融合成自噬溶酶體后被降解［16］。當(dāng)自噬活性減弱后，能夠造成細(xì)胞質(zhì)中p62蛋白的積累，因此p62蛋白的檢測能夠間接反映單元自噬小體的清除程度［17］。

凋亡途徑分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑，由Bcl-2組成的線粒體途徑是缺血心肌細(xì)胞凋亡的重要途徑之一［18］。Bcl-2作為重要的抗凋亡蛋白，能夠抑制線粒體通透轉(zhuǎn)換孔的開放，從而抑制細(xì)胞的凋亡，Bax作為促凋亡蛋白之一，作用與Bcl-2相反，且能夠通過多種途徑激活凋亡途徑，因此Bcl-2/Bax的比值更加能夠體現(xiàn)二者對細(xì)胞凋亡的實際調(diào)控作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，再灌注能夠調(diào)控急性心肌梗死后心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，從而減少梗死周邊缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡［20］。

他汀類藥物能夠通過抑制膽固醇合成的限速酶，從而降低血清脂蛋白和膽固醇，延遲缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的死亡，減輕心肌再灌注誘發(fā)的損傷，改善心功能，在防治心血管疾病方面越來越受到重視［21］。高俊甲研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀預(yù)處理可有效改善再灌注大鼠的血流動力學(xué)紊亂，改善無復(fù)流現(xiàn)象，從而減少心肌梗死的面積［22］。中醫(yī)學(xué)不僅能夠從多靶點、多層面改善再灌注后無復(fù)流現(xiàn)象，減少惡性事件的發(fā)生，還能能夠最大程度地改善患者的生存質(zhì)量，降低死亡率［23］。本研究首次采用電針預(yù)處理防治再灌注無復(fù)流，研究結(jié)果顯示：電針能夠顯著降低再灌注大鼠心肌組織中Beclin1、LC3Ⅱ、p62/SQSTM1蛋白的表達(dá)，增加LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)，調(diào)控LC3Ⅰ與LC3Ⅱ之間的轉(zhuǎn)換；另一方面，電針能夠顯著增加再灌注大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)，降低Bax蛋白的表達(dá)，從而升高心肌組織中Bcl-2/Bax的比例，改善無復(fù)流現(xiàn)象的出現(xiàn)，減少心肌梗死的面積。

綜上所述，電針預(yù)處理能夠改善急性心肌梗死再灌注無復(fù)流現(xiàn)象，減少心肌梗死的面積，其作用機制可能是通過調(diào)控心肌細(xì)胞自噬和凋亡水平實現(xiàn)的。