鄒翠美， 馬瑞林， 胡付品， 朱泳璋， 任 崢

近年來，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的檢出率上升明顯[1-3]，引起醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的高度關(guān)注。由于不同地區(qū)CRKP產(chǎn)生的碳青霉烯酶類型不同，可能與各地區(qū)使用抗菌藥物種類不同有關(guān)[4]，特別是兒童疾病中以感染性疾病居多，是抗菌藥物應(yīng)用最多的群體，兒童患者由于免疫力較低更容易感染CRKP[5]。因此，研究銀川市第一人民醫(yī)院（我院）內(nèi)兒童患兒中CRKP的分子流行特征，對遏制其流行播散有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌 收集我院2014－2016年所有新生兒病區(qū)（NICU）和普通兒科病房患者CRKP菌株共16株，剔除同一患者分離的重復(fù)菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基及抗菌藥物 哥倫比亞瓊脂和Mueller-Hinton瓊脂購自英國OXOID公司，常規(guī)使用自動(dòng)化儀器法和紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏紙片購自英國OXOID公司，復(fù)核使用的亞胺培南E試驗(yàn)條和美羅培南E試驗(yàn)條為英國OXOID公司的微生物藥敏試紙。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌鑒定藥敏試驗(yàn)采用BD公司的phoenix 100全自動(dòng)鑒定藥敏系統(tǒng)及其配套試劑。參照2016年CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測定16株菌對抗菌藥物敏感性，結(jié)果判讀按照CLSI 2016年折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，來自衛(wèi)計(jì)委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2.2 碳青霉烯酶表型及基因型檢測 3'-氨基苯硼酸（APB）和乙二胺四乙酸（EDTA）協(xié)同試驗(yàn)表型檢測肺炎克雷伯菌中的碳青霉烯酶。含EDTA或APB厄他培南與單厄他培南抑菌圈直徑相差≥5 mm提示產(chǎn)金屬酶或KPC型碳青霉烯酶。PCR法擴(kuò)增碳青霉烯酶（KPC、 NDM、IPM、VIM）、AmpC酶（MOX、CIT、DHA、ACC、EBC、FOX ）、超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）（CTX-M、OXA）和TEM型β內(nèi)酰胺酶基因，所用引物參考相應(yīng)文獻(xiàn)[6-8]。PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)DNA測序并分析具體基因型別。

1.2.3 接合試驗(yàn) 選用對利福平耐藥的大腸埃希菌EC600作為受體菌，CRKP作為供體菌進(jìn)行質(zhì)粒接合試驗(yàn)。供體菌和受體菌分別在MH肉湯中培養(yǎng)后，按照1∶1混合后加入新鮮的MH肉湯中，靜置 35 ℃孵育18～20 h，取100 μL混合液涂布在含600 mg/L利福平和25 mg/ L氨芐西林的MH篩選平皿上孵育18～24 h，在含藥平皿上挑取單個(gè)菌落接種到CHROMagar顯色平皿上判斷是否為接合子，對接合子進(jìn)行目的基因PCR 擴(kuò)增及藥敏試驗(yàn)。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳（PFGE） 采用PFGE對16株CRKP進(jìn)行同源性分析，菌株經(jīng)Xba I酶切后包埋于1%瓊脂糖凝膠中，在無硫脲的含0.5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液中進(jìn)行PFGE，沙門菌H9812為參考菌株。酶切圖譜按照美國CDC TENOVER等推薦的方法判讀[9]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌

16株CRKP中，13株分離自新生兒患者，3株分離自普通兒科患者，年齡范圍2 d～3個(gè)月。4株來自血標(biāo)本、11株來自痰標(biāo)本、1株來自氣管導(dǎo)管末端標(biāo)本。

2.2 藥敏試驗(yàn)

16株CRKP對多黏菌素E、阿米卡星、環(huán)丙沙星100%敏感，對頭孢菌素類、碳青霉烯類藥物100%耐藥，對哌拉西林-他唑巴坦11.1%敏感?；驕y序結(jié)果顯示，6株金屬β內(nèi)酰胺酶基因陽性，包括2株blaNDM-16、2株blaIPM-34和2株blaIPM-4，其余10株均未檢出碳青霉烯酶基因，而檢出blaCTX-M（CTX-M-65、CTX-M-3、CTX-M-15）和AmpC酶（DHA-1）的耐藥基因。見表1。

2.3 CRKP耐藥基因水平傳播及分子流行病學(xué)

接合試驗(yàn)：將未檢出碳青霉烯酶B類金屬酶的CRKP抽取2株做供體菌，與受體菌EC600接合，接合后經(jīng)PFGE證實(shí)，EC600獲得耐藥質(zhì)粒，其藥敏結(jié)果也與供體菌一致。

2.4 臨床信息

入院患兒分布：13例新生兒病例中早產(chǎn)兒7例，窒息3例，肺炎1例，先天性心臟病1例，發(fā)熱待查1例；3例普兒科患兒中2例重癥肺炎，1例支氣管炎?？咕幬锸褂们闆r，普兒科、NICU基本

首選頭孢他啶、頭孢呋辛、阿莫西林-克拉維酸、青霉素；嚴(yán)重感染患兒或是檢出CRKP則使用美羅培南，未使用過其他類抗菌藥物，其中1例先天性心臟病患兒痰分離出CRKP未使用抗菌藥物?；純恨D(zhuǎn)歸情況，16例患兒14例好轉(zhuǎn)出院，2例放棄治療出院。16例患兒臨床信息見表2。

表1 16株CRKP基因型及對常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 MICs of selected antimicrobial agents against 16 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains and the corresponding genotype（mg/L）

表2 16例患兒臨床信息Table 2 Clinical data of 16 pediatric patients

2.5 同源性分析

PFGE顯示，16株CRKP共發(fā)現(xiàn)6個(gè)克隆株，其中 A 型5株、C 型4株、B 型3株、D型2株、E型和F型各1株。部分菌株P(guān)FGE結(jié)果見圖1。

3 討論

根據(jù)我院常規(guī)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示 ，兒科送檢的微生物標(biāo)本占全院微生物標(biāo)本的一半以上，碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌中肺炎克雷伯菌最多見，主要集中在兒科病房[10]。2014年以前我院兒科病房未檢出CRKP。2014年5月首先在NICU中10 d內(nèi)3例患兒血液中相繼檢出CRKP，2015年12月在NICU前后半個(gè)月2例患兒痰培養(yǎng)檢出CRKP，2016年上半年NICU每月報(bào)告1例或2例患兒痰培養(yǎng)檢出CRKP。普兒科僅在2016年2月第1次報(bào)告，一對雙胞胎痰培養(yǎng)中同時(shí)檢出CRKP，同年4月報(bào)告1例患兒痰培養(yǎng)檢出CRKP。普兒科3例患兒均是在入院當(dāng)日送檢痰培養(yǎng)后檢出CRKP。NICU的13例CRKP中僅有38.5%（5/13）是入院48 h內(nèi)檢出，61.5%（8/13）是入院48 h以后檢出，其中8例來源于痰，4例來源于靜脈血，1例來源于氣管導(dǎo)管末端。

圖1 部分菌株P(guān)FGE同源性分析圖Figure 1 Pulsed-field gel elelectrophoresis patterns of 8 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates

藥敏結(jié)果顯示，與國內(nèi)報(bào)道相同的是未發(fā)現(xiàn)對多黏菌素耐藥菌株，不同的是CRKP對環(huán)丙沙星、阿米卡星的高敏感性，對β內(nèi)酰胺類及酶抑制劑復(fù)方制劑和碳青霉烯類藥物未見敏感菌株[11]。

目前，碳青霉烯類抗生素因具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)，是治療多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染的最后一道防線。不同地區(qū)CRKP產(chǎn)生的碳青霉烯酶類型不同，國內(nèi)外報(bào)道最多的碳青霉烯酶是KPC基因型，兒童患者產(chǎn)金屬酶如IMP-4基因型較多見，NDM型偶有報(bào)道[11-12]，本研究收集2014－2016年兒童患者分離的16株CRKP中，未檢出KPC酶，只檢出6株產(chǎn)金屬酶，其他10株CRKP菌株金屬酶檢測表型試驗(yàn)陽性但基因型檢測為陰性，抽取2株菌2007和2119做接合試驗(yàn)，與大腸埃希菌EC600接合成功，證明碳青霉烯酶耐藥基因位于可移動(dòng)質(zhì)?；蚧蛟?，存在著傳播風(fēng)險(xiǎn)，但未檢測到耐藥基因，推測是否可能是某種金屬酶的變異體或新型金屬碳青霉烯酶導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，今后需進(jìn)一步研究。

根據(jù)PFGE的結(jié)果分析，CRKP在新生兒科的為A 型、C 型、B型，普兒科為D型；新生兒菌株1973、2007、2106、1918具有同源性，提示CRKP在NICU內(nèi)有流行，要著重監(jiān)控CRKP病例，需引起感染科和醫(yī)護(hù)人員的高度重視，及時(shí)采取隔離措施，防止醫(yī)院感染暴發(fā)。