阮紅剛， 付潮泓， 許臘梅

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[1]。原發(fā)性肺癌是指癌變起源于肺內組織，常因肺內支氣管上皮、支氣管腺體、肺泡上皮等部位異常改變，進而引發(fā)癌變[2]。有文獻報道 ，肺癌的發(fā)生與結核分枝桿菌-L型（MTB-L）感染存在密切聯(lián)系，可能為該病的新誘因[3]。MTB-L是MTB常見的變異類型，其發(fā)生常因各種不利因素共同作用，進而誘導基因發(fā)生突變，造成細胞壁結構部分或完全缺失所致[4]。國外有研究發(fā)現(xiàn)，MTB-L某些小的原生質體及濾過相與病毒存在一定相似度，因此感染后?？蛇M入人體體細胞，并可將自身DNA整合到侵入細胞染色體上，激活原癌基因及抑制抑癌基因可能是引起癌變的主要原因[5]。同時MTB-L還可以依靠血液中抗體、補體、溶酶素及其可抑制免疫細胞活性而長期存在，再通過黏附紅細胞表面向全身擴散[6]。由于MTB-L的細胞壁存在缺陷，因此對藥物敏感性改變較大，同時在普通培養(yǎng)基中存活率較低，加大臨床診斷難度。鑒于MTB-L對癌癥的一系列作用，因此對其有效的檢測及耐藥性分析，對臨床診治意義重大。本文對原發(fā)性肺癌患者的MTB-L及其耐藥性檢測結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年6月－2015年8月收治的原發(fā)性肺癌患者89例。納入標準：①均滿足2015新版《原發(fā)性肺癌診療指南》中的診斷標準[7]；②術后病理學檢查證實為原發(fā)性肺癌，且檢查前未接受抗癌治療；③均未接受放療、化療及免疫治療。排除標準：①合并嚴重的心腦血管、肝腎器官組織疾病；②繼發(fā)性肺癌患者；③合并嚴重免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、傳染性疾病患者；④長期服用抗菌藥物治療患者。所有患者中男性54例、女性35例，平均年齡為（48.8±7.4）歲（31～72歲），平均腫瘤直徑為（3.35±0.84）cm，其中腺癌患者41例、鱗癌患者25例、細支氣管肺泡癌患者14例、小細胞未分化癌患者9例；組織學分級為I級患者31例、II級患者42例、III級患者16例。

1.2 方法

采用原位分子雜交技術（in situ hybridiation，ISH）對MTB-L的MPB64基因片段進行檢測，從MTB H37RV標準株的MPB64基因片段選取My2500224和My310283片段，采用深圳市華榮發(fā)電子測試有限公司生產的合成探針和生物素對其進行標記，MPB64探針合成序列：5'-CGGTA TCGGT GCCTT TCAAC TCCTC GC-3'和 5'-GGGCA GGCTGATGTT GATGT TGTAGGC-3'，同時本研究中為提高檢測率，將其進行混合使用，將石蠟包埋的組織標本進行常規(guī)脫蠟，所有步驟均參照ISH試劑盒中的操作說明書進行。采用IK抗酸染色對MTB-L進行檢測。同時對檢測出的MTB-L感染陽性患者的痰液標本以平板劃線法進行MTB-L分離，具體方法為：用接種環(huán)以無菌操作蘸取少許痰液，在無菌培養(yǎng)皿表面進行連續(xù)劃線，隨時間延長，培養(yǎng)皿上生長的典型“油煎蛋”狀菌落即為L型菌落，挑取目標菌落多次重復上述操作，達到分離純化的目的。并對分離株行利福平及異煙肼等藥物的藥敏試驗，藥敏試驗操作嚴格參照文獻[8]中擬定操作進行 。

1.3 觀察指標

觀察所有原發(fā)性肺癌患者肺癌組織標本中MTB-L陽性檢出率，同時對陽性痰標本進行MTB-L分離和藥敏試驗，對肺癌組織中MTB-L檢測陰性者痰標本以同樣的方法進行MTB-L分離，觀察菌落生長情況。統(tǒng)計MTB-L對各類抗菌藥物的耐受性，并比較多重耐藥（MDR）與廣泛耐藥（XDR）的MTB-L對各種抗菌藥物耐藥性差異。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究所有記錄結果均由2人建立數(shù)據(jù)庫，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理，計數(shù)資料以[n（%）]表示，并采用χ2檢測，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTB和MTB-L陽性檢出率

在89例原發(fā)性肺癌組織標本中檢測出34例MTB-L陽性，陽性率為38.2%，陽性患者痰標本均分離到MTB-L菌株，共計63株，陰性患者痰標本均未見MTB-L特征性菌落生長。34例MTB-L陽性患者中腺癌患者15例，鱗癌患者10例，細支氣管肺泡癌患者5例，小細胞未分化癌患者4例，結果顯示不同組織分型患者MTB-L陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果顯示原發(fā)性肺癌患者以MTB-L感染為主，幾乎無MTB感染。

2.2 MTB-L對一線抗結核藥耐藥性

63株MTB-L對一線抗結核藥物的耐藥率為57.1%（36株），其中對異煙肼單藥使用的耐藥率為6.3%，對異煙肼聯(lián)合鏈霉素、利福平、乙胺丁醇使用的耐藥率為20.6%，見表1。

2.3 MTB-L對二線抗結核藥耐藥性

MTB-L對二線抗結核藥物的耐藥率為31.7%（20株），其中對氧氟沙星單藥使用的耐藥率為11.1%，對氧氟沙星聯(lián)合卷曲霉素、阿米卡星使用的耐藥率為7.9%，見表2。

表1 63株MTB-L對一線抗結核藥物耐藥率Table 1 Resistance of 63 L-type Mycobacterium tuberculosis strains to the first line anti-tuberculosis drugs

表2 63株MTB-L對二線抗結核藥物耐藥率Table 2 Resistance of 63 L-type Mycobacterium tuberculosis strains to the second line anti-tuberculosis drugs

2.4 MDR和XDR的MTB的耐藥率比較

63株MTB-L 中MDR株占36.5%，XDR株占12.7%，MDR菌株的耐藥率明顯高于XDR菌株（χ2=9.63，P=0.001），見表3。

表3 63株MTB-L 中MDR與XDR株的耐藥率比較Table 3 Comparative resistance rates of multi-drug resistant （MDR） and extensively drug ressitant （XDR） strains in the 63 L-type Mycobacterium tuberculosis strains

3 討論

肺癌作為臨床最為常見的惡性腫瘤，調查顯示，近50年世界各國肺癌發(fā)生率及病死率均明顯上升，已占男性惡性腫瘤中發(fā)病率及病死率的首位，同時占女性惡性腫瘤發(fā)病率及病死率的第二位[9]，嚴重威脅著人們的健康及生命。大量研究已證實，吸煙及二手煙是肺癌發(fā)生的最重要因素，煙草中大量化學物質具有致癌作用，可導致細胞轉化引起癌變。隨著對肺癌研究深入，有研究發(fā)現(xiàn)，MTB-L在原發(fā)性肺癌患者的腫瘤組織中具有較高的檢出率，且相關研究顯示，MTB-L也具有一定致病性[10]，可能在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，但目前還無確證報道。有研究認為MTB-L的致肺癌發(fā)生可能為：①MTB-L能夠進入肺泡上皮細胞中的細胞核，并將DNA整合到細胞核染色體上，激活原癌基因及抑制抑癌基因，誘導細胞癌變；②MTB-L可引起組織持續(xù)性慢性炎性反應，造成肺組織過度增生；③肺組織中局部結核性支氣管擴張鈣化及瘢痕的產生，使局部靜脈淋巴回流受阻，致大量致癌物質聚集刺激鄰近肺組織誘發(fā)癌變[11]。也有研究顯示，在MTB-L感染的肺癌組織中脆性組氨酸三聯(lián)體蛋白相比正常組織存在明顯異常表達，結果顯示MTB-L發(fā)揮致癌作用可能與改變某些基因有關[12]。本研究中對89例原發(fā)性肺癌組織中MTB-L檢測顯示，MTB-L的陽性表達率為38.2%，而MTB陽性表達率僅為1.1%，結果表明MTB-L感染可能與原發(fā)性肺癌發(fā)生存在相關性。

根據(jù)WHO關于肺癌的組織學分型，主要分為鱗癌、腺癌、小細胞癌、細支氣管肺泡癌及大細胞癌，且研究證實不同組織分型肺癌組織中基因表達存在明顯差異，因此有學者認為MTB-L可能在不同組織分型肺癌中陽性表達率存在差異性。本研究以MTB MPB64基因片段為探針，采用IK抗酸染色方法對MTB-L的陽性表達及存在部位進行檢測，結果顯示不同組織分型肺癌組織中MTB-L陽性表達率無明顯差異（P＞0.05），與國內王梅梅等[13]報道一致。同時本研究還對肺癌MTB-L陽性表達組織中分離出的MTB-L進行藥敏試驗， MTB-L對一線抗結核藥物的耐藥率為57.1%，對二線抗結核藥物的耐藥率為31.7%，其中對一線抗結核藥物異煙肼和鏈霉素具有較高耐藥率，且對于異煙肼單藥使用及異煙肼與其他藥物聯(lián)合使用均具有一定耐藥性，因此臨床治療中應減少對異煙肼的使用。有研究還發(fā)現(xiàn)[14]，MTB-L對二線抗結核藥物均存在較高耐藥性，本研究顯示氧氟沙星耐藥率最高達11.1%，因此臨床需避免氧氟沙星單藥使用。此外本研究還對MDR和XDR的MTB的耐藥率進行比較，結果顯示XDR菌株的耐藥率為12.7%，明顯低于MDR菌株的耐藥率36.5%（P＜0.01），且發(fā)現(xiàn)4種藥物聯(lián)合使用的耐藥率明顯高于3種或2種藥物聯(lián)合使用，提示多種抗結核藥物治療可能使療效降低，還能增加耐藥性[15]，因此臨床不建議3種以上藥物聯(lián)合治療。

綜上所述，原發(fā)性肺癌患者以MTB-L感染為主，MTB-L對異煙肼及二線抗結核藥物存在較高耐藥率，且多藥聯(lián)合使用可能會降低療效，增加MTB-L耐藥率。臨床治療中應結合患者情況、藥物耐藥性檢測，合理選用抗菌藥物。