崔 曉，叢倩倩，王慶武，安秀榮

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院食用菌研究所，山東 泰安 271000）

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius） 又名袖珍菇，學(xué)名為肺形側(cè)耳。20世紀(jì)后期由臺(tái)灣地區(qū)引進(jìn)[1]，屬真菌門 （Mycobionta） 擔(dān)子菌綱 （Homobasidiomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 側(cè)耳科 （Pleurotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus）[2]。因其外形近似平菇，子實(shí)體朵形較小，在部分地區(qū)又被稱為“小平菇”。秀珍菇質(zhì)地脆嫩，味道鮮美，且營(yíng)養(yǎng)豐富，其不僅富含人體所需的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從中提取的多糖更具有抗腫瘤功效[3]。秀珍菇的市場(chǎng)前景廣闊，也為食用菌育種工作提供了優(yōu)良親本。

原生質(zhì)體育種是食用菌育種工作的重要內(nèi)容，早期的原生質(zhì)體分離主要采用機(jī)械法破除細(xì)胞壁，自英國(guó)學(xué)者Cocking發(fā)明了酶解法[4]后，開創(chuàng)了大量獲得原生質(zhì)體的新技術(shù)。多年來，酶解法制備原生質(zhì)體廣泛用于食用菌研究中。1972年，Vries和Wessels[5]用裂解酶酶解得到了裂褶菌原生質(zhì)體。1989年毛木耳和黑木耳通過種間原生質(zhì)體融合得到新品種[6]，90年代以來上海市農(nóng)科院通過原生質(zhì)體單核化技術(shù)雜交得到香菇品種“申香”系列[7－9]。在食用菌研究中，原生質(zhì)體的制備不僅在育種[10－14]中起著基礎(chǔ)研究作用，同時(shí)也為菌種脫毒復(fù)壯[15－16]提供了新思路。

目前對(duì)秀珍菇原生質(zhì)體的研究較少且著重在原生質(zhì)體制備單因素方面[17－18]，本試驗(yàn)采用多因素正交組合的方法，明確了秀珍菇原生質(zhì)體的最佳制備條件，并得到秀珍菇原生質(zhì)體再生最適宜的培養(yǎng)基。以期建立秀珍菇原生質(zhì)體的高效制備轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)細(xì)胞水平的育種工作和其他遺傳研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

供試菌株為夏秀，引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，如圖1。

圖1 秀珍菇菌株夏秀子實(shí)體Fig．1 Fruitbody of Pleurotus pulmonarius strain xiaxiu

1.2 試劑試劑

溶壁酶（lywallzyme）[19]，購自廣東省微生物研究所；蝸牛酶（snailase），購自索萊寶（Solaibio） 公司；纖維素酶（cellulase），購自索萊寶（Solarbio）公司。

注射器中放入厚2 cm左右的脫脂棉，高壓滅菌后備用。

1.3 培養(yǎng)基

PDA（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基） 培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200 g、葡萄糖 20 g、KH2PO43 g、MgSO41．5 g、瓊脂20g，加水定容至1L。使每平板定量為20mL。

TB3[20－21]再生培養(yǎng)基：酵母提取物3 g、酸水解酪蛋白3 g、蔗糖200 g、葡萄糖10 g、瓊脂8 g，加水定容至1 L。

改良PD培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨 5 g、KH2PO43 g、MgSO41．5 g，加水定容至1 L。

2 試驗(yàn)方法

2.1 酶液配制

以溶壁酶穩(wěn)滲劑為試劑，配置成濃度（W·V－1）為1%、1．5%、2%、2．5%、3%的酶液，在無菌條件下用0．22 μm的微孔濾膜過濾除菌備用。

2.2 穩(wěn)滲劑配制

以蔗糖、甘露醇、MgSO4·7H2O、KCl為溶質(zhì)，配制濃度（n·V－1）為0．6 mol·L－1穩(wěn)滲劑溶液，高壓滅菌后備用。

2.3 原生質(zhì)體的制備

首先將菌種母種在斜面培養(yǎng)基（PDA） 上進(jìn)行活化，25℃培養(yǎng)數(shù)天后轉(zhuǎn)接到改良PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，再將其置于50 mL離心管中6 000 r·min－1～10 000 r·min－1離心 15 min，去掉上清。分別用無菌水清洗1次，穩(wěn)滲劑清洗2次收集菌絲。按照菌絲濕重（500 mg） 和酶液（1 mL） 的比例添加酶液，然后在25℃下進(jìn)行水浴酶解2 h。水浴過程中每15分鐘振蕩離心管，待酶解完畢時(shí)，吸取少量酶解液用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。原生質(zhì)體如圖2所示。

圖2 秀珍菇菌株夏秀原生質(zhì)體Fig．2 Protoplast of Pleurotus pulmonarius strain xiaxiu

2.4 原生質(zhì)體的純化

在離心管中加入5倍～7倍穩(wěn)滲劑以停止酶解反應(yīng)。使用含有脫脂棉的注射器過濾除去菌絲，2 000 r·min－1離心15 min去掉酶液。得到的原生質(zhì)體沉淀用穩(wěn)滲劑清洗2次，即為純化的原生質(zhì)體懸浮液。

2.5 復(fù)合因素對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

采用正交試驗(yàn)，篩選秀珍菇原生質(zhì)體制備的最佳條件組合。采用L9(34)正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab．1 Factors and levels of orthogonal test

2.6 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證

通過正交試驗(yàn)結(jié)果（各因素K值大小）得到理論最佳條件并進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)理論條件得到的原生質(zhì)體濃度同正交試驗(yàn)中得到的直接最佳結(jié)果進(jìn)行差異顯著性試驗(yàn)。

2.7 原生質(zhì)體的再生

用穩(wěn)滲劑將原生質(zhì)體懸浮液稀釋至原生質(zhì)體濃度到104數(shù)量級(jí)。然后將原生質(zhì)體懸浮液接種到TB3再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

接種再生方式有3種，a直接涂菌法：用移液槍吸取200 μL原生質(zhì)體懸浮液滴到已冷卻至完全凝固的再生培養(yǎng)基平板上；b單層混菌法：用移液槍吸取200 μL原生質(zhì)體懸浮液加到冷卻至40℃～45℃的TB3再生培養(yǎng)基中，混勻后倒入滅菌的平板中；c雙層混菌法：用移液槍吸取200 μL原生質(zhì)體懸浮液加到冷卻至40℃～45℃的TB3再生培養(yǎng)基中，混勻后倒入TB3再生培養(yǎng)基平板中。封口后用手轉(zhuǎn)動(dòng)平板至懸浮液均勻布滿平板。

用無菌水代替液體再生培養(yǎng)基，稀釋原生質(zhì)體懸浮液待原生質(zhì)體漲破后涂平板作為對(duì)照，以消除菌絲片段形成菌落而產(chǎn)生的誤差。每個(gè)處理重復(fù)5次，放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待5 d左右菌落數(shù)不再增加時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比較原生質(zhì)體的再生情況。原生質(zhì)體再生率（P）的計(jì)算公式為：

P（%） =(n1-n2)×100/n

式中：n1表示原生質(zhì)體再生菌落數(shù)；n2表示對(duì)照平板中菌落數(shù)；n1-n2表示絕對(duì)再生菌落數(shù)；n表示涂布的原生質(zhì)體數(shù)。

2.8 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理并進(jìn)行方差分析，每個(gè)處理5次重復(fù)。采用Duncan’s新復(fù)極差法統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 供試菌株夏秀的栽培特性

如圖1所示，夏秀菌株的菇體較小，菌蓋較厚，菌蓋直徑小于3 cm，菌蓋厚0.4 cm～0.6 cm，灰白色至淺褐色，菌柄長(zhǎng)5 cm～6 cm，菌柄粗0.5 cm～1.3 cm，子實(shí)體散生。菌絲生長(zhǎng)溫度為10℃～35℃，最適宜生長(zhǎng)溫度25℃～30℃；子實(shí)體生長(zhǎng)溫度為10℃～32℃。屬秀珍菇中的中高溫品種，優(yōu)點(diǎn)突出[22]。

3.2 復(fù)合因素對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

對(duì)菌齡、酶解時(shí)間、酶解溫度、穩(wěn)滲劑種類4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，通過上述單因素試驗(yàn)得到最佳單因素條件，以之為基礎(chǔ)確定正交試驗(yàn)的3個(gè)水平值，采用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。綜合評(píng)價(jià)如表2所示。

根據(jù)K值大小，得到秀珍菇原生質(zhì)體制備的最佳條件組合為A2B2C3D2，即：菌齡5 d、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度30℃、0.6 mol·mL-1甘露醇為穩(wěn)滲劑。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test

R值越大，說明因子對(duì)所得原生質(zhì)體的濃度影響越大。極差分析結(jié)果表明，4個(gè)單因子的影響順序?yàn)椋篋＞C＞A＞B，即穩(wěn)滲劑種類對(duì)秀珍菇原生質(zhì)體濃度影響最大，酶解溫度、菌齡居次，酶解時(shí)間影響最小。

3.3 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證

L9(34)正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of verification test

由表 3 可知，T=127．35，μ=T/9 （14．15），正交試驗(yàn)中直接最佳結(jié)果為試驗(yàn)7，在A3B1C3D2條件下，可得秀珍菇原生質(zhì)體濃度為 3．39×107個(gè)·mL－1；根據(jù)K值可得正交試驗(yàn)理論最佳條件為A2B2C3D2，根據(jù)此條件制備秀珍菇原生質(zhì)體，其濃度為4．23×107個(gè)·mL－1。同時(shí)由表3可知，3個(gè)數(shù)值中正交試驗(yàn)理論最佳條件所得的數(shù)值最大，且與其他二者呈顯著性差異。

3.4 原生質(zhì)體的再生

原生質(zhì)體的再生情況見圖2、表4。

圖2 秀珍菇菌株夏秀原生質(zhì)體的再生Fig．2 Protoplast regeneration of Pleurotus pulmonariusstrain Xiaxiu

表4 不同接種方式對(duì)夏秀原生質(zhì)體再生的影響Tab．4 Effects of different inoculation method on protoplast regeneration of Pleurotus pulmonarius strain Xiaxiu

原生質(zhì)體的接種方式對(duì)原生質(zhì)體再生率的大小具有一定影響，3種接種方式所得的夏秀原生質(zhì)體再生率大小為：b＞a＞c，其中采用單層混菌法接種原生質(zhì)體再生率最大為2．35%。

4 討論

在秀珍菇原生質(zhì)體制備過程中有多個(gè)影響原生質(zhì)體分離的因素，如果將所涉及的多個(gè)因素一一組合進(jìn)行試驗(yàn)，工作量過大且效率太低。因此，引入正交試驗(yàn)方法是十分必要的。

原生質(zhì)體制備的本質(zhì)是通過酶解破除細(xì)胞壁使原生質(zhì)體游離出來，因此酶的選擇是至關(guān)重要的。在食用菌側(cè)耳屬相關(guān)介紹中，多采用溶壁酶、纖維素酶、蝸牛酶，或者多種酶混合進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)中，以上述3種酶作為試驗(yàn)對(duì)象。纖維素酶的效果較差，鏡檢時(shí)能看到未充分溶解的方形晶體。而植物原生質(zhì)體制備時(shí)，纖維素酶效果較好[23－24]。筆者推測(cè)原因有2個(gè)，一是真菌細(xì)胞壁的成分復(fù)雜，纖維素酶作為單一酶類無法破壁完全，二是纖維素酶的溶解條件和夏秀的酶解條件（如穩(wěn)滲劑的選擇及濃度）不同且存在一定差距，從而影響了纖維素酶的酶解效果。

本試驗(yàn)通過最佳制備條件得到的夏秀原生質(zhì)體最大濃度為 4．23×107個(gè)·mL－1，介于萬南安[17]與于清偉[18]所得結(jié)果之間。分析具體原因有2個(gè)，一是所選取的秀珍菇品種不同，造成得到的結(jié)果不同。萬南安和于清偉選取的秀珍菇品種同本試驗(yàn)的試驗(yàn)對(duì)象夏秀為不同品種，品種的差異造成菌絲原生質(zhì)體制備時(shí)具體濃度和影響條件不同。但各因素的總體趨勢(shì)基本一致。所得的原生質(zhì)體濃度隨著酶濃度的升高、酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這進(jìn)一步啟示我們，是否不同品種的秀珍菇或其他種類食用菌，都會(huì)呈現(xiàn)不同的生物學(xué)特性和不同的原生質(zhì)體制備條件。那么原生質(zhì)體的制備是否和其自身的生物學(xué)特性具有某種相關(guān)性。二是前兩者都是只進(jìn)行了單因素試驗(yàn)且都采用多因素逐項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即將前一步得到的單因素A最優(yōu)值代入后一步單因素試驗(yàn)B中。而前一步單因素最優(yōu)值的結(jié)果影響下一步單因素試驗(yàn)的結(jié)果，即單因素試驗(yàn)順序的選擇影響最終試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步證明正交試驗(yàn)的必要性。

原生質(zhì)體的再生接種方式是影響原生質(zhì)體再生率的重要因素[25]，本試驗(yàn)采用單層混菌法將原生質(zhì)體懸浮液接種到TB3培養(yǎng)基中所得的再生率為2．35%，明顯高于其他作者關(guān)于秀珍菇原生質(zhì)體再生率0．85%的試驗(yàn)結(jié)果[17，26]，具體分析原因，一是接種方式的選擇，單層混菌法的接種方式優(yōu)勢(shì)明顯，其結(jié)果高于直接涂菌法和雙層混菌法。二是接種后個(gè)人操作方法，接種后大多選擇用涂布棒進(jìn)行涂布，而涂布棒會(huì)對(duì)原生質(zhì)體造成機(jī)械損傷，使原生質(zhì)體破裂，本試驗(yàn)在接種封口后，用手輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使原生質(zhì)體分布均勻，避免損傷。三是再生培養(yǎng)基的選擇，筆者在預(yù)試驗(yàn)中選用PDA、TB3、MYG（麥芽糖酵母膏）再生培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)TB3的再生率高出其他2種。

無機(jī)鹽、糖類和糖醇都是秀珍菇原生質(zhì)體制備時(shí)適宜的滲透壓穩(wěn)定劑，不同穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體制備、再生有很大的影響。本試驗(yàn)中，有機(jī)類溶液作為穩(wěn)滲劑效果優(yōu)于無機(jī)穩(wěn)滲劑。與何小慧[27]、王金斌等[28]的試驗(yàn)結(jié)果相同。

5 結(jié)論

原生質(zhì)體的分離和再生是兩個(gè)相互聯(lián)系的過程，原生質(zhì)體的制備濃度和再生率的大小是影響后續(xù)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的重要因素[29－30]，而本試驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，確定了秀珍菇原生質(zhì)體制備的最佳條件為：秀珍菇菌絲在改良液體PD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng) 5 d，以 0．6 mol·mL－1甘露醇為穩(wěn)滲劑，2．5%溶壁酶按酶液和菌絲（濕重）為2∶1的體積質(zhì)量比混合在30℃條件下水浴4 h，所得原生質(zhì)體濃度最大，濃度為 4．23×107個(gè)·mL－1。各因素的影響順序?yàn)榉€(wěn)滲劑種類＞酶解溫度＞菌齡＞酶解時(shí)間。通過單層混菌法接種原生質(zhì)體于TB3再生培養(yǎng)基，再生率最高，為2．35%。