華正根 ，王金亮 ，2，朱麗萍 ，吳長(zhǎng)輝 ，2，姚渭溪 ，2，李 曄 *

（1．福建仙芝樓生物科技有限公司，福建 福州 350002；2．國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，福建 福州 350002）

靈芝（Ganoderma lucidum） 又稱瑞草、仙草，性平味甘，為我國(guó)名貴的傳統(tǒng)中藥材，一直被中華傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)視為滋補(bǔ)強(qiáng)身、固本扶正的珍貴中草藥。

靈芝的成分豐富，包括靈芝多糖、三萜及甾醇成分、核苷、蛋白質(zhì)和微量元素等，其中靈芝三萜和甾醇成分以及靈芝多糖是最主要的活性物質(zhì)，近年來(lái)一直是研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究靈芝及其提取物發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝，降低血糖，抑制血管緊張素、抗氧化等功效[1]；靈芝多糖具有抗腫瘤、衰老，提高免疫力，清除自由基，降低血糖等功效[2]；靈芝甾醇具有增強(qiáng)人體抵抗疾病的能力，降低血液中的膽固醇濃度，預(yù)防前列腺疾病等功效[3]。這些成分各起作用，且成分之間又有協(xié)同作用。

目前，對(duì)靈芝中的靈芝多糖、三萜成分研究較多[4－5]，對(duì)靈芝甾醇類化合物的研究相對(duì)較少。在傳統(tǒng)的提取工藝中，提取靈芝中三萜及甾醇類化合物的方法通常有乙醇回流提取法、有機(jī)溶劑提取法、微乳提取法，為了能夠更加有效地提高溶劑的提取效率，需要新技術(shù)的輔助，如超聲波、微波等輔助提取[6]。

超臨界CO2提取技術(shù)，自20世紀(jì)60年代在咖啡豆內(nèi)脫除咖啡因、提取啤酒花浸膏等方面實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化后，在食品香料、化工材料、中醫(yī)中藥和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。由于高壓密封及其安全等方面的限制，目前超臨界CO2提取的產(chǎn)業(yè)化設(shè)備的提取壓力大多在35 MPa。鑒于CO2的非極性特性，提取脂溶性成分主要采用35 MPa的超臨界CO2提取壓力，若提取低極性成分，通常需要在CO2中添加少量的極性溶劑（例如乙醇）作為夾帶劑，但是，如果想要除去進(jìn)入提取物中的極性溶劑，也會(huì)帶來(lái)許多新問(wèn)題。隨著技術(shù)進(jìn)步，當(dāng)前許多超臨界CO2產(chǎn)業(yè)化設(shè)備能達(dá)到50 MPa，與提取壓力35 MPa設(shè)備相比，壓力的提高使超臨界CO2的密度增大，提高了提取能力，而且不添加夾帶劑，除了能提取脂溶性成分外，還能提取部分低極性成分。在有關(guān)單位協(xié)助下，使用105 MPa的高壓超臨界CO2設(shè)備采用梯度高壓對(duì)提取的靈芝成分進(jìn)行了初探，試驗(yàn)表明提高超臨界CO2設(shè)備的提取壓力，能夠增加超臨界CO2介質(zhì)的密度和溶解能力，能從靈芝細(xì)粉中提取出更多的靈芝三萜和甾醇成分，將為靈芝提取提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇、乙腈為色譜純；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水；靈芝細(xì)粉（40目～60目），福建仙芝樓生物科技有限公司自制；靈芝酸A、B、C1標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；麥角甾醇，福建省食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器

LC－20AD液相色譜儀，日本島津公司；KQ－100E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；A1140型萬(wàn)分之一電子分析天平，美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；DK－S28電熱恒溫水浴鍋，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；超臨界提取裝置，德國(guó)伍德超臨界設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1．3．1 超臨界CO2提取靈芝三萜及甾醇的研究

（1）超臨界工藝流程

超臨界工藝流程圖如圖1所示。

圖1 超臨界工藝流程圖Fig．1 Flow chart of supercritical process

（2） 高壓超臨界CO2提取試驗(yàn)

按照超臨界CO2提取的工藝流程圖所示，將靈芝細(xì)粉1 kg裝入提取釜，按設(shè)定的溫度和CO2流量進(jìn)行高壓提取，考察不同提取壓力（30 MPa、65MPa、85 MPa、105 MPa） 條件下的提取情況，從分離釜中收集提取物，于65℃進(jìn)行干燥。稱取提取物0．10 g，加入乙醇20 mL，超聲處理45 min，定容，離心（轉(zhuǎn)速 4 000 r·min－1，離心 10 min） 得上清液，高效液相色譜測(cè)定靈芝三萜和甾醇的含量，計(jì)算靈芝三萜和甾醇的提取含量。靈芝中三萜和甾醇含量（N，%） 公式為：

式中：m1表示靈芝三萜和甾醇的質(zhì)量，g；m2表示靈芝細(xì)粉的質(zhì)量，g。

1．3．2 傳統(tǒng)乙醇回流提取試驗(yàn)

稱取靈芝細(xì)粉，加入95%乙醇溶劑進(jìn)行回流提取，提取工藝參數(shù)[7]：料液比1:10，提取溫度80℃，提取時(shí)間1．5 h，提取3次。

1．3．3 提取物樣品HPLC分析

（1）樣品溶液的制備

分別稱取乙醇回流提取法提取的醇提取物和高壓超臨界CO2提取法的提取物0．1 g，加甲醇，超聲溶解，4 000 r·min－1，離心 10 min，取上清液，0．45 μm濾膜濾過(guò)，上C18色柱譜。

（2）對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取5．0 mg的靈芝酸B、A、C1共3種靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品和麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入甲醇5．0 mL，分別配成 1．0 mg·mL－1的對(duì)照品溶液。

（3）靈芝三萜酸的高效液相色譜法測(cè)定

色譜條件：安捷倫 Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈 （A） －甲醇（B） －0．4%甲酸水溶液（C），梯度洗脫程序?yàn)?時(shí)，A：20%，B：20%，C：60%；30 min時(shí)，A：30%，B：20%，C：50%；35 min時(shí)，A：38%，B：20%，C：42%；40 min時(shí)，A：20%，B：20%，C：60%；45 min時(shí)，A：20%，B：20%，C：60%；流速：1．0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL。

按峰面積歸一化方法，將10 min～25 min所有峰的峰面積總和，以標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸B的質(zhì)量和峰面積計(jì)算出這個(gè)范圍內(nèi)總靈芝酸含量；25 min～29 min所有峰的峰面積總和，以標(biāo)準(zhǔn)品芝酸A的質(zhì)量和峰面積計(jì)算出這個(gè)范圍內(nèi)總靈芝酸含量；29 min～40 min所有峰的峰面積總和，以標(biāo)準(zhǔn)品芝酸C1的質(zhì)量和峰面積計(jì)算出這個(gè)范圍內(nèi)總靈芝酸含量，將這三個(gè)時(shí)間段計(jì)算出的靈芝酸含量相加即為靈芝三萜含量。

（4） 麥角甾醇的高效液相色譜法測(cè)定

色譜條件：安捷倫 Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇 （A） －0．5%乙酸水溶液（B），梯度洗脫程序?yàn)?～45 min時(shí)，A：60%→100%；45 min～70 min時(shí)，A：100%～100%，流速：1．0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm，柱溫：35℃，進(jìn)樣量：10 μL。

（5）靈芝三萜和甾醇成分的高效液相色譜圖對(duì)照

色譜條件：色譜柱，安捷倫Eclipse XDB－C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇 （A） －0．5%醋酸水（B），梯度洗脫程序?yàn)?～30 min時(shí)，A：50%→80%；30 min～35 min時(shí)，A：80%→85%；35 min～65 min時(shí)，A：85%→85%；65 min～70 min時(shí)，A：85%→95%；70 min～80 min時(shí)，A：95%→95%；80 min～85 min時(shí)，A：95%→100%；85 min～110 min 時(shí)，A：100%→50%，流速：1．0 mL·min－1，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓超臨界CO2提取試驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果

設(shè)定提取溫度為50℃，提取時(shí)間為4．0 h，分離壓力為10 MPa，分離溫度為40℃，CO2流量為12 L·h－1，收集提取壓力分別為 30 MPa、65 MPa、85 MPa、105 MPa條件下的提取物，觀察靈芝三萜和甾醇成分含量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取壓力對(duì)靈芝三萜和麥角甾醇含量的影響Fig．2 Effect of extraction pressure on the content of triterpene and ergosterol in Ganoderma lucidum

提取壓力影響CO2的密度，是影響CO2溶解能力的重要因素。由圖2中可以看出，靈芝三萜和麥角甾醇含量隨著提取壓力的升高而增大，當(dāng)提取壓力為85 MPa時(shí)，靈芝三萜含量為1．34%，麥角甾醇的含量達(dá)到0．32%，繼續(xù)升高壓力，超臨界CO2提取法的提取效率也隨之提高，但提取效率提高較少，并且提取壓力過(guò)高，會(huì)增加設(shè)備的損耗和成本。綜上所述，確定最佳提取壓力為85 MPa。其優(yōu)化的工藝條件為：提取壓力85 MPa，提取溫度50℃，提取時(shí)間4 h，在此條件下，靈芝三萜含量為1．35%，麥角甾醇含量為0．32%。

2.2 高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法比較

靈芝三萜和甾醇成分的提取方法較多，但是普遍采用的是乙醇回流提取法。本試驗(yàn)采用同一批次的靈芝細(xì)粉原料分別進(jìn)行高壓超臨界提取法和乙醇回流提取法比較。

2．2．1 靈芝三萜成分比較

以靈芝酸B、A、C1作為標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果見(jiàn)圖3、表1。

由圖3可以看出，在相同的樣品進(jìn)樣濃度和體積條件下，高壓超臨界CO2提取法的提取物與乙醇回流提取法的提取物有同樣的峰形，可見(jiàn)2種方法都能將靈芝三萜成分提取出來(lái)，三萜含量高低不同。

表1結(jié)果表明，與乙醇回流提取法相比，高壓超臨界CO2提取法提取溫度較低，靈芝三萜和麥角甾醇含量分別比乙醇回流提取法高了46.7%、60%，而提取時(shí)間較乙醇回流提取法短?？梢?jiàn)高壓超臨界CO2提取法具有耗時(shí)短、提取率高、效益高等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法提取靈芝三萜的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography(HPLC)of Ganoderma lucidum triterpene extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

表1 高壓超臨界CO2提取方法與乙醇回流提取方法比較Tab.1 Comparison of high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

2.2.2 甾醇成分的比較

以麥角甾醇作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖4、表1。

由圖4可以看出，在相同的樣品進(jìn)樣濃度和體積條件下，在出峰時(shí)間56 min時(shí)，高壓超臨界CO2提取法的提取物與乙醇回流提取法的提取物有同樣麥角甾醇的峰，但前者麥角甾醉的含量比后者高。

2.2.3 高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法的HPLC圖譜比較

高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法的HPLC圖譜的比較結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可以看出，在相同的樣品進(jìn)樣濃度和體積條件下，在20 min～40 min高壓超臨界CO2提取法的提取物的出峰個(gè)數(shù)比乙醇回流提取法的提取物多，而在其他出峰時(shí)間2種提取物的出峰數(shù)量、保留時(shí)間基本保持相同，色譜峰峰形也極其相似，這說(shuō)明高壓超臨界CO2提取法提取出的三萜和甾醇成分的種類比乙醇回流提取法多。

圖4 高壓超臨界CO2提取法與乙醇回流提取法提取的麥角甾醇的高效相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography(HPLC)of ergosterol extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

圖5 高壓超臨界CO2提取和乙醇回流提取樣品的HPLC譜圖Fig.5 HPLC spectra of samples extracted by high pressure supercritical CO2extraction and ethanol reflux extraction

3 討論

超臨界CO2提取技術(shù)作為1種提取新工藝，因其提取時(shí)間短，無(wú)污染，產(chǎn)品品質(zhì)好，同時(shí)有效地避免了傳統(tǒng)提取工藝對(duì)天然成分尤其是對(duì)熱敏性物質(zhì)的影響而倍受青睞，具有廣闊的發(fā)展前景。本試驗(yàn)以靈芝三萜和甾醇成分含量為考察指標(biāo)，通過(guò)不同提取壓力試驗(yàn)對(duì)超臨界CO2高壓提取工藝條件進(jìn)行篩選，確定提取工藝條件為：提取壓力85 MPa，提取溫度50℃，提取時(shí)間4 h，CO2流量為12 L·h-1。試驗(yàn)表明，隨著提取壓力的提高，超臨界CO2提取法的提取效率也隨之提高，但到達(dá)85 MPa時(shí)會(huì)趨于平衡，因此提取壓力不是越高越好。

由于靈芝三萜和甾醇成分難溶于水，易溶于乙醇、甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑[8]，但因甲醇、氯仿毒性比乙醇大，且乙醇提取法是傳統(tǒng)的提取方法，故該試驗(yàn)選擇將乙醇回流提取法和超臨界CO2提取法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，與乙醇回流提取法相比，高壓超臨界CO2提取法提取溫度較低，靈芝三萜和甾醇成分含量分別比乙醇回流提取法高出46.7%、60%，而提取時(shí)間較乙醇回流提取法短?？梢?jiàn)超高壓CO2提取法具有提取率高、耗時(shí)短、效益高等優(yōu)點(diǎn)。HPLC圖譜表明，高壓超臨界CO2提取法的提取物中三萜和甾醇成分種類較多。靈芝子實(shí)體主要成分由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，纖維化結(jié)構(gòu)高達(dá)80%以上，結(jié)構(gòu)致密，具有較好的維持力，而靈芝成分附著于細(xì)胞壁、細(xì)胞內(nèi)，較難滲出，在提取過(guò)程中，高壓力破壞了靈芝細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)外的壓力差增大，超臨界CO2就能輕易地進(jìn)入靈芝細(xì)胞內(nèi)，靈芝中三萜和甾醇等成分被高效地提取出來(lái)。

高壓超臨界CO2提取法，由于對(duì)設(shè)備要求高、費(fèi)用高、容積小等問(wèn)題，目前該法尚處在研究探索的階段，但其對(duì)于其他物料的提取具有一定的參考價(jià)值。