陳向齊 宋洪濤 陳勝平

[摘要]目的：探討5-氨基酮戊酸光動(dòng)力（5-aminolevulinicacid photodynamic therapy，5-ALA-PDT）對(duì)大鼠痤瘡模型局部免疫功能的影響及相關(guān)機(jī)制。方法：將痤瘡丙酸桿菌接種大鼠耳部，建立大鼠痤瘡炎癥模型，給予5-ALA-PDT治療。對(duì)組織進(jìn)行HE染色，采用免疫組化法檢測(cè)大鼠巨噬細(xì)胞CD68、CD163、Toll樣受體2（Toll-like receptor-2，TLR2）、髓樣分化因子88（MyD88）的表達(dá)。結(jié)果：痤瘡丙酸桿菌接種于大鼠耳部可建立大鼠痤瘡炎癥模型，HE染色見大量炎性細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)。CD68、CD163、TLR2、MyD88在大鼠耳部皮膚炎癥細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，空白組較少，接種P.acnes后表達(dá)增高，加激動(dòng)劑Pam3CSK4后表達(dá)更高，5-ALA-PDT治療后較P.acnes組低。結(jié)論：大鼠耳部毛囊皮脂腺及周圍可少量表達(dá)TLR2，接種痤瘡丙酸桿菌后，表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞向毛囊皮脂腺周圍聚集。5-ALA-PDT治療后TLR2表達(dá)減少，減弱機(jī)體對(duì)細(xì)菌的免疫反應(yīng)，從而減輕炎癥。

[關(guān)鍵詞]5-氨基酮戊酸；光動(dòng)力；痤瘡丙酸桿菌；痤瘡；CD68；CD163；TLR2；MyD88

[中圖分類號(hào)]R758.73+3 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）06-0051-04

Abstract： Objective To study the influence of 5-ALA-PDT on the Toll-like receptor-mediated immune response in acne model in SD rats. Methods Acne inflammation model of rat ear induced by Propionibacterium acnes were established and then treated with 5-ALA-PDT. Section was made for HE staining. Immunohistochemical staining was used to observe the expression of CD68， CD163， TLR2， and MyD88. Results Acne inflammation model of rat ear was established by inoculating Propionibacterium acnes to rat ears. Diffuse infiltrations of inflammatory cell were observed by HE staining. Compared with the blank group， the expression of CD68， CD163， TLR2， MyD88 were decreased in rat ears inflammatory cells， but increased after stimulated with P.acnes and increased further after Pam3CSK4 adminstration. The expression level decreased and was lower than the model group after received 5-ALA-PDT. Conclusion TLR2 expression was low in rat ear pilosebaceous unit and its surrounding tissue and the expression increased significantly after inoculating Propionibacterium acnes， which induced macrophage infitration in pilosebaceous unit. 5-ALA-PDT decreased the expression of TLR2 and alleviates bodys immune response to bacteria， thus relieved inflammation

Key words： 5-aminolevulinic acid； photodynamic therapy； Propionibacterium acnes； acne vulgaris； CD68； CD163； TLR2； MyD88

痤瘡病變第一步為以毛囊皮脂腺單位的亞臨床微粉刺，可能演變成封閉或開放粉刺和炎性病變，如丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)和囊腫。粉刺形成被認(rèn)為是涉及到毛囊的角化過(guò)度，繼發(fā)于毛囊濾泡角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度角化以及它們脫屑減少。炎性細(xì)胞因子IL-1參與此過(guò)程，并誘導(dǎo)角化過(guò)度。微粉刺或粉刺后來(lái)可能發(fā)展成炎癥病變，結(jié)果CD4+T細(xì)胞活化和遷移，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌細(xì)胞因子以及巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞聚集到毛囊、皮脂腺，增強(qiáng)皮脂分泌[1]。其中，導(dǎo)致痤瘡的發(fā)病因素主要是痤瘡丙酸桿菌，是正常皮膚菌群的一部分，但它在痤瘡患者的毛囊皮脂腺內(nèi)明顯增加[2]。痤瘡丙酸桿菌通過(guò)誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1和IL-8導(dǎo)致炎癥發(fā)生，特別是IL-8以及其它痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的趨化因子可召集嗜中性粒細(xì)胞到毛囊皮脂腺中發(fā)揮重要作用。此外，痤瘡丙酸桿菌釋放的脂肪酶、蛋白酶和透明質(zhì)酸酶可導(dǎo)致組織損傷[3]。然而，這種細(xì)菌在痤瘡的發(fā)病機(jī)制中的確切作用仍需進(jìn)一步闡明。

1 材料和方法

1.1 菌液的制備：挑取單個(gè)痤瘡丙酸桿菌（ATCC6919，廣東微生物研究所）的菌落，并接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）中，在37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3d，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ?jì)數(shù)，以生理鹽水調(diào)配細(xì)菌濃度至1×108cells/ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理：從福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)置清潔級(jí)雌性SD大鼠[合格證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001]48只，均為3周齡，體重約100～120g。經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)（批件號(hào)：2014038）審核認(rèn)證。實(shí)驗(yàn)前大鼠耳部備皮。備皮清理完畢后，48只大鼠隨機(jī)分成4組，空白組、P.acnes組、P.acnes+Pam3CSK4（激動(dòng)劑，北京中科邁晨科技有限公司）組、P.acnes+ALA-PDT組，每組各12只。空白組雙耳注射無(wú)菌生理鹽水（50μl/200g）。厭氧環(huán)境下培養(yǎng)痤瘡丙酸桿菌，并接種于其余3組SD大鼠雙耳（50μl/200g），誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)1周后，用無(wú)菌針頭挑取耳廓腫脹部位，接種于厭氧腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在37℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)3d，證明為痤瘡丙酸桿菌感染[4]。對(duì)P.acnes+ALA-PDT組的大鼠進(jìn)行5-ALA-PDT治療，常規(guī)酒精消毒照射區(qū)皮膚，腹腔注射氯胺酮（100mg/kg）麻醉動(dòng)物，P.acnes+ALA-PDT組大鼠雙耳外敷5% ALA（上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司），避光封包1.5h，擦拭干凈后用LED-IB光動(dòng)力治療儀（武漢亞格光電技術(shù)有限公司）照射。照光方案為每周1次，共3周。參數(shù)設(shè)定為：能量密度100mW/cm2，波長(zhǎng)（633±10nm），照射時(shí)間設(shè)定為10min，能量60J/cm2?？瞻捉M、P.acnes組、P.acnes+Pam3CSK4 組大鼠均于注射后第3周處死，P.acnes+ALA-PDT組大鼠于5-ALA-PDT治療完畢后立即處死。

1.3 免疫組化法檢測(cè)各組CD68、CD163、TLR2、MyD88表達(dá)情況：常規(guī)石蠟切片，HE染色。石蠟切片脫蠟和水化，組織抗原用高壓修復(fù)。每張切片加1滴3%過(guò)氧化氫溶液，在室溫下孵育10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。每張切片加入1滴一抗（CD68、MyD88的濃度為1：100，CD163、TLR2的濃度為1：50）[CD68、CD163（大鼠）多克隆抗體，購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司；TLR2多克隆抗體購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司；MyD88多克隆抗體購(gòu)自上海安研商貿(mào)有限公司]，室溫下孵育60min。每張切片加入1滴聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），在室溫下孵育20min。每張切片加入1滴酶標(biāo)抗鼠聚合物（試劑B），在室溫下孵育30min。每張切片加入2滴新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性顯色為棕黃色。蒸餾水沖洗3次，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，最后用PBS沖洗1次，水性封片劑封片。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)：TLR2、MyD88、CD68、CD163陽(yáng)性表達(dá)位于上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，TLR2在細(xì)胞膜也有表達(dá)，鏡下所見均為棕黃色顆粒狀。以CD68、CD163、TLR2和MyD88陽(yáng)性染色強(qiáng)度及（或）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為3級(jí)：陰性（-）：有10%以下大鼠耳部巨噬細(xì)胞著色；弱陽(yáng)性（±）：11%～50%以下大鼠耳部巨噬細(xì)胞著色；陽(yáng)性（+）：有50%以上大鼠耳部巨噬細(xì)胞著色[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，等級(jí)資料行多組非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis Test），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠耳部皮膚外觀大體表現(xiàn)：空白組大鼠耳部皮膚正常；P.acnes組大鼠耳部皮膚紅腫明顯；P.acnes+Pam3CSK4組大鼠耳部皮膚紅腫顯著；光動(dòng)力治療后大鼠耳部皮膚紅腫消退，顏色接近正常。見圖1。

2.2 大鼠耳部皮膚組織病理檢測(cè)結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠表皮較薄，毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)正常；P.acnes組可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；P.acnes+Pam3CSK4 組有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；P.acnes+ALA-PDT組毛囊真皮層可見少量炎性細(xì)胞。見圖2。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 大鼠耳部皮膚TLR2含量檢測(cè)結(jié)果：TLR2免疫組化染

色結(jié)果顯示主要在大鼠耳部上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)彌漫性陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色，毛囊、皮脂腺也有陽(yáng)性表達(dá)（見圖3）。P.acnes+Pam3CSK4 組含量最高，各組具體情況見表1。

2.3.2 大鼠耳部皮膚MyD88含量檢測(cè)結(jié)果：MyD88免疫組化染色結(jié)果顯示主要在大鼠耳部上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)彌漫性陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色，毛囊、皮脂腺也有陽(yáng)性表達(dá)（見圖4）。P.acnes+Pam3CSK4 組含量最高，各組具體情況見表2。

2.3.3 大鼠耳部皮膚CD68含量檢測(cè)結(jié)果：CD68免疫組化染色結(jié)果顯示主要在大鼠耳部上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)彌漫性陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色，毛囊、皮脂腺也有陽(yáng)性表達(dá)（見圖5）。P.acnes+Pam3CSK4組含量最高，各組具體情況見表3。

2.3.4 大鼠耳部皮膚CD163含量檢測(cè)結(jié)果：CD163免疫組化染色結(jié)果顯示主要在大鼠耳部上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)彌漫性陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色，毛囊、皮脂腺也有陽(yáng)性表達(dá)（見圖6）。P.acnes+Pam3CSK4 組含量最高，各組具體情況見表4。

3 討論

3.1 TLR2：目前，10多種TLRs在人類中確定，這些受體的微生物配體已被證實(shí)，TLR4能介導(dǎo)宿主對(duì)革蘭陰性菌脂多糖反應(yīng)，TLR2介導(dǎo)宿主革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖反應(yīng)，而TLR5介導(dǎo)宿主對(duì)細(xì)菌鞭毛蛋白反應(yīng)[6]。當(dāng)Toll樣受體暴露于微生物的配體后被激活，TLR的胞內(nèi)部分可能引發(fā)MyD88依賴性途徑參與，比如IL-1受體相關(guān)激酶和腫瘤壞死因子受體活化因子6，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的核轉(zhuǎn)位。NF-κB然后調(diào)節(jié)許多免疫反應(yīng)基因[7]。

Kim J等[3]用TLR基因敲除小鼠檢查由痤瘡丙酸桿菌介導(dǎo)的激活的TLR6與TLR1的作用。腹膜巨噬細(xì)胞是從野生型、TLR2-/-、TLR6-/-和TLR1-/-TLR2-/-小鼠獲得，用痤瘡丙酸桿菌激活，并且上清液測(cè)定炎性細(xì)胞因子IL-6的存在。痤瘡丙酸桿菌能誘導(dǎo)野生型小鼠、TLR1-/-小鼠和TLR6-/-小鼠的IL-6釋放，但TLR2-/-小鼠沒有。這些結(jié)果表明是TLR2介導(dǎo)痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞活化，而不是TLR4、TLR6或TLR1。本次結(jié)果顯示P.acnes組TLR2的表達(dá)較空白組高，說(shuō)明大鼠耳部接種痤瘡丙酸桿菌后TLR2受體表達(dá)增高，與Kim J等[3]的結(jié)果一致。P.acnes+ALA-PDT組平均秩和較P.acnes組低，說(shuō)明5-ALA-PDT治療后大鼠耳部TLR2表達(dá)減少。

3.2 髓樣分化因子（MyD88）：MyD88是Toll樣受體信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵的銜接分子，在上游信息傳遞和疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。MyD88結(jié)構(gòu)上有3個(gè)功能區(qū)域：N-端死亡區(qū)，中間區(qū)域和C末端區(qū)的Toll區(qū)。Toll區(qū)類似于IL-1受體的胞質(zhì)區(qū)，通過(guò)招募連接蛋白來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明激動(dòng)劑可通過(guò)激動(dòng)TLR2激活MyD88。P.acnes+ALA-PDT組較P.acnes組低，說(shuō)明5-ALA-PDT治療后大鼠耳部MyD88表達(dá)減少，然而下游信號(hào)仍有待進(jìn)一步研究。

3.3 巨噬細(xì)胞CD68、CD163的表達(dá)：巨噬細(xì)胞可以清除衰老的宿主細(xì)胞和分子，在抵抗感染中也起著重要作用[9]，這是在炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵角色之一，主要是在以下幾個(gè)方面：炎癥周圍高濃度趨化因子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，并使巨噬細(xì)胞向感染部位募集，激活的巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分泌IL-8等因子，引起更多的巨噬細(xì)胞活化募集，釋放促炎細(xì)胞因子如IL-6和前列腺素等炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)并加重局部炎癥反應(yīng)[10]。CD68、CD163可以作為M2型巨噬細(xì)胞活化的重要的標(biāo)志物[11]。本次P.acnes組CD68的表達(dá)較空白組高，說(shuō)明大鼠耳部接種痤瘡丙酸桿菌后CD68表達(dá)增高，和Kim J等[3]的結(jié)果一致。P.acnes+ALA-PDT組平均秩和較P.acnes組低，說(shuō)明5-ALA-PDT治療后大鼠耳部炎癥減輕。且P.acnes組CD163的表達(dá)較空白組高，說(shuō)明大鼠耳部接種痤瘡丙酸桿菌后CD163表達(dá)增高，和Kim J等[3]的研究結(jié)果一致，且5-ALA-PDT治療后表達(dá)降低。

3.4 TLR2激動(dòng)劑Pam3CysSK4：Pam3CysSK4是一種合成的細(xì)菌脂肽，是TLR2的特異性激動(dòng)劑。已有研究證實(shí)TLR2激動(dòng)劑Pam3CysSK4可以增加CD8+T細(xì)胞數(shù)量并加速炎癥進(jìn)程[12]。采用TLR2的激動(dòng)劑Pam3CysSK4來(lái)干預(yù)大鼠耳部，以了解TLR2信號(hào)通路在體內(nèi)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：TLR2激動(dòng)劑Pam3CysSK4刺激TLR2表達(dá)增多，可能會(huì)進(jìn)一步加劇大鼠耳部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了這條通路在痤瘡的發(fā)病中的作用。

綜上所述，大鼠耳部毛囊皮脂腺及周圍可少量表達(dá)TLR2，接種痤瘡丙酸桿菌后，表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞向毛囊皮脂腺周圍聚集。5-ALA-PDT治療后TLR2表達(dá)減少，減弱機(jī)體對(duì)細(xì)菌的免疫反應(yīng)，從而減輕炎癥。TLR2可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，為尋常痤瘡治療提供了一種特異性靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)可能會(huì)促進(jìn)治療尋常痤瘡新藥物的研發(fā)。

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[收稿日期]2017-12-20 [修回日期]2018-05-02

編輯/朱婉蓉