余南榮 黃志良 吳成杰 魯偉群 楊國(guó)華 徐厚巍 劉海鷹

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤外科（廣州 510095）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer）的發(fā)病率和死亡率近年在我國(guó)有持續(xù)升高的趨勢(shì)。早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療成為提高結(jié)直腸癌治愈率及延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的關(guān)鍵。但目前臨床中仍缺乏對(duì)結(jié)直腸癌早期診斷敏感且特異的腫瘤標(biāo)志物，因此尋找更敏感和高特異性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)成為臨床亟待解決的問(wèn)題。

Septin9基因甲基化是結(jié)直腸癌重要的生物學(xué)特征之一，其在結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織中均高表達(dá)，而在健康人群或其他結(jié)直腸疾病中呈低表達(dá)［1-2]。因此，Septin9基因甲基化有可能成為結(jié)直腸癌篩查診斷和治療監(jiān)測(cè)的一個(gè)候選標(biāo)志物。但目前關(guān)于血漿甲基化Septin9在結(jié)直腸癌術(shù)后監(jiān)測(cè)、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)、評(píng)估生存等方面的報(bào)道較少，僅有小型病例研究結(jié)果表明Septin9甲基化可用于結(jié)直腸癌術(shù)后的隨訪監(jiān)測(cè)，并初步顯示其與結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存呈負(fù)相關(guān)。此外，雖然血漿Septin9甲基化及血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）在結(jié)直腸癌診斷和監(jiān)測(cè)中都有重要作用，但每個(gè)指標(biāo)單獨(dú)作為結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)測(cè)指標(biāo)都不能準(zhǔn)確而完整地反映病情。因此，本研究擬通過(guò)采集結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后及化療前后的外周血液，檢測(cè)血漿Septin9甲基化及血清CEA的表達(dá)并探索二者在結(jié)直腸癌診斷、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)方面的作用，從而為血漿Septin9甲基化成為結(jié)直腸癌診斷及監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的標(biāo)志物提供可靠的臨床依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及病例入組標(biāo)準(zhǔn)于2015年12月至2016年4月間入組符合以下標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)直腸癌患者：（1）既往未接受過(guò)任何抗腫瘤治療；（2）術(shù)后病理診斷證實(shí)為結(jié)直腸腺癌；（3）患者首次治療為手術(shù)切除或FOLFOX方案化療。同期收集30例我院自愿者健康人血液標(biāo)本作為對(duì)照。病例剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往接受過(guò)抗腫瘤治療的患者；（2）術(shù)后病理診斷證實(shí)為非結(jié)直腸腺癌者；（3）患者首次治為非FOLFOX方案化療者。本研究已通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象已知情并簽署知情同意書。

1.2 血漿樣本的收集和保存對(duì)符合條件的結(jié)直腸腺癌病例依據(jù)治療方式進(jìn)行分組：手術(shù)組血液標(biāo)本的采集時(shí)間為：手術(shù)前、手術(shù)后4周；化療組血液采集時(shí)間為：化療前、2次化療后。每例血液樣本均詳細(xì)記錄對(duì)應(yīng)患者的一般資料、臨床信息、病理資料等。采樣時(shí)抽取10 mL/支靜脈全血2支，分別以EDTA抗凝和真空無(wú)抗凝處理，用于提取血漿和血清。樣本可立即用于Septin9基因甲基化和CEA測(cè)定，或保存于-20℃低溫冰箱，4周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 血清CEA蛋白和血漿Septin9基因甲基化的檢測(cè)血清CEA表達(dá)水平由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科采用放射免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)。采用Septin9基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎz測(cè)血漿Septin9甲基化水平。按照試劑盒說(shuō)明書步驟對(duì)血漿中DNA進(jìn)行提取、磁珠結(jié)合、洗滌和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理，然后每個(gè)DNA樣本中按比例加入相應(yīng)體積的PCR反應(yīng)液和PCR聚合酶（PCR Master Mix），按照常規(guī)PCR擴(kuò)增進(jìn)行40個(gè)熱循環(huán)后讀取數(shù)據(jù)結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，所有樣本均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有假設(shè)檢驗(yàn)比較均為雙側(cè)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料兩組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用行×列χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者血漿Septin9甲基化和血清CEA的表達(dá)情況在2015年12月至2016年4月間共收集符合條件的結(jié)直腸癌血漿樣本35例和健康人群血漿樣本30例。35例患者中，治療前血漿Septin9甲基化陽(yáng)性表達(dá)26例，陰性表達(dá)9例，陽(yáng)性率為74.3%（26/35）；血清CEA高于正常對(duì)照值（5.0 ng/mL）的有21例，正常范圍內(nèi)的有14例，陽(yáng)性率為60.0%（21/35）。健康人群中血漿Septin9甲基化陽(yáng)性0例，陰性30例，陽(yáng)性率為0.0%（0/30）；血清CEA高于正常對(duì)照值（5.0 ng/mL）的有3例，正常范圍內(nèi)的有27例，陽(yáng)性率為10.0%（3/30）。Septin9甲基化和血清CEA在結(jié)直腸癌患者和健康人群中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌患者及健康人血漿Septin9甲基化和血清CEA的表達(dá)情況Tab.1 Comparison of plasma Septin9 methylation andserum CEA in colorectal cancerpatients and health controls

2.2 治療前后結(jié)直腸癌患者血漿Septin9甲基化的表達(dá)35例結(jié)直腸癌患者中有26例直接接受手術(shù)治療，另外9例接受FOLFOX方案化療。手術(shù)組中有20例術(shù)前為Septin9甲基化陽(yáng)性，6例為陰性；經(jīng)手術(shù)完全切除腫瘤后由陽(yáng)性變?yōu)殛幮?5例（轉(zhuǎn)陰率為75.0%），持續(xù)陽(yáng)性5例，持續(xù)陰性的6例；術(shù)前血清CEA陽(yáng)性（＞5.0 ng/mL）的有15例，陰性（＜5.0 ng/mL）有11例，術(shù)后由陽(yáng)性變?yōu)殛幮?1例（轉(zhuǎn)陰率為73.3%），持續(xù)陽(yáng)性4例，持續(xù)陰性的11例。

在化療組中，化療前血漿Septin9甲基化陽(yáng)性有6例，陰性3例，經(jīng)化療后由陽(yáng)性變?yōu)殛幮?例（轉(zhuǎn)陰率16.7%），持續(xù)陽(yáng)性5例，持續(xù)陰性3例；化療前血清CEA陽(yáng)性（＞5.0 ng/mL）的有6例，陰性（＜5.0 ng/mL）有3例，化療后由陽(yáng)性變?yōu)殛幮?例（轉(zhuǎn)陰率為16.7%），持續(xù)陽(yáng)性5例，持續(xù)陰性有3例。分析結(jié)果顯示，無(wú)論對(duì)于血漿Septin9甲基化或血清CEA水平，手術(shù)治療后指標(biāo)轉(zhuǎn)陰率較化學(xué)治療更高（P=0.010，P=0.018）。見(jiàn)表2。

表2 手術(shù)治療和化學(xué)治療前后血漿Septin9甲基化血清CEA水平的變化Tab.2 Changes of plasma Septin9 methylation，serumCEA before and after operation and chemotherapy

2.3 血漿Septin9甲基化與臨床病理特征的相關(guān)性通過(guò)記錄每例樣本的性別、年齡、腫瘤位置及TNM分期等臨床資料，與血漿Septin9甲基化檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析（因35例結(jié)直腸癌患者中有2例無(wú)法確定病理分期，因此TNM分期與血漿Septin9甲基化相關(guān)性分析只納入33例患者）。結(jié)直腸癌患者血漿Septin9甲基化與臨床各病理參數(shù)的相關(guān)性如表3所示，Septin9甲基化水平與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期和是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

2.4 血漿Septin9甲基化和血清CEA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌診斷的意義上述部分結(jié)果表明血漿Septin9甲基化與臨床結(jié)直腸癌診斷的相符率為74.3%，血清CEA對(duì)結(jié)直腸癌診斷陽(yáng)性率為60.0%，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.203），提示兩者診斷效能相類似。為進(jìn)一步分析兩種分子標(biāo)志物對(duì)提高結(jié)直腸癌診斷的準(zhǔn)確性，筆者分析了血漿Septin9甲基化聯(lián)合血清CEA水平對(duì)結(jié)直腸癌的診斷率，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的陽(yáng)性率為82.9%，較單獨(dú)檢測(cè)血清CEA水平的陽(yáng)性率明顯升高（P=0.034）。見(jiàn)表4。

表3 35例結(jié)直腸癌患者血漿Septin9甲基化與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab.3 Relationship between plasma Septin9 methylation and clinicopathological parametersin 35 colorectal cancer patients

表4 血漿Septin9甲基化和血清CEA水平檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌診斷比較Tab.4 Comparison of the diagnostic value between plasma Septin9 methylation and serum CEA

3 討論

Septin基因廣泛存在于絕大多數(shù)真核生物中，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)14個(gè)Septin基因，分別被命名為Septin1～Septin14?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Septin家族與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、感染、不育癥等疾病發(fā)生有關(guān)。Septin基因家族相關(guān)的腫瘤疾病包括白血病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌等實(shí)體腫瘤。Septin9定位于染色體17q25.3，該染色體區(qū)段是散發(fā)性卵巢癌和乳腺癌的常見(jiàn)雜合性丟失部位。研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與基因的甲基化密切相關(guān)［3]，基因芯片檢測(cè)結(jié)果分析表明Septin9在乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮內(nèi)膜、腎臟、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、軟組織、皮膚、甲狀腺等來(lái)源的腫瘤中高表達(dá)。

目前有研究表明血漿Septin9甲基化在結(jié)直腸癌診斷中具有一定的意義［4-12]。學(xué)者發(fā)現(xiàn)直結(jié)腸癌患者患病的過(guò)程中體內(nèi)的部分基因發(fā)生甲基化，將甲基化的異?；蜃鳛榉肿訕?biāo)記物對(duì)于疾病的篩查具有一定的可操作性［13-14]。GRüTZMANN等［15]進(jìn)行了結(jié)直腸癌患者血漿甲基化Septin9檢測(cè)研究，其結(jié)果顯示血漿甲基化Septin9在結(jié)直腸癌患者中的陽(yáng)性率為48%（120/252），明顯高于健康對(duì)照組的7%（7/102）?？蒂坏龋?6]研究表明，結(jié)直腸癌患者血漿中Septin9基因甲基化檢測(cè)的靈敏度為75.0%，特異度為98.1%，優(yōu)于糞便隱血試驗(yàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，Septin9基因甲基化檢測(cè)結(jié)直腸癌不受年齡和性別的影響，但其基因甲基化水平與種族有一定的相關(guān)性［17-18]。本研究通過(guò)分析結(jié)直腸癌患者治療前后血漿Septin9甲基化狀態(tài)與血清CEA蛋白水平，發(fā)現(xiàn)血漿Septin9甲基化對(duì)結(jié)直腸癌的診斷陽(yáng)性率與血清CEA水平相似，兩者聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高診斷陽(yáng)性率；治療后血漿Septin9甲基化狀態(tài)也可出現(xiàn)相應(yīng)變化，提示其也可用于治療期間的病情監(jiān)測(cè)。

在本研究中，結(jié)直腸癌患者中Septin9的甲基化水平顯著高于健康人群，其陽(yáng)性率達(dá)到74.3%，再加上血漿Septin9甲基化水平檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、靈敏度較高的優(yōu)勢(shì)，故筆者認(rèn)為其是輔助結(jié)直腸癌診斷較為理想的指標(biāo)。在本研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)手術(shù)組結(jié)直腸癌患者中，手術(shù)切除腫瘤后血漿Septin9甲基化由陽(yáng)性變化為陰性的比例顯著高于化療組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.010），提示Septin9的甲基化水平與結(jié)直腸癌患者的帶瘤狀態(tài)顯著相關(guān)，并具有類似于血清CEA可監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌患者治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛能，但其預(yù)測(cè)作用及其特異性仍需進(jìn)一步研究。

由于本研究的結(jié)果提示血漿Septin9甲基化與血清CEA均有輔助結(jié)直腸癌診斷的作用，但單獨(dú)檢測(cè)血漿Septin9甲基化或血清CEA仍容易漏診一部分結(jié)直腸癌患者；且在健康人群中，血清CEA也存在一定的假陽(yáng)性率，目前關(guān)于血漿Septin9甲基化和血清CEA聯(lián)合檢測(cè)的報(bào)道較少，需進(jìn)一步對(duì)該方向進(jìn)行深入研究。為此，本研究分析了血漿Septin9甲基化與血清CEA水平聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷陽(yáng)性率，其結(jié)果為82.9%，與CEA單獨(dú)檢測(cè)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034），提示血漿Septin9甲基化與血清CEA的聯(lián)合檢測(cè)可以提高結(jié)直腸癌檢測(cè)的陽(yáng)性率。同時(shí)Septin9的甲基化水平檢測(cè)可提示結(jié)直腸癌患者的荷瘤狀態(tài)。因此，檢測(cè)Septin9的甲基化水平，特別是與CEA聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，血漿Septin9甲基化水平的檢測(cè)具有可作為結(jié)直腸腺癌的篩查和診斷指標(biāo)的潛能，其對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能與血清CEA相類似，陽(yáng)性符合率高達(dá)74.3%，且本研究中Septin9甲基化水平診斷結(jié)直腸癌的敏感性稍優(yōu)于血清CEA水平的檢測(cè)。若將血漿Septin9甲基化水平檢測(cè)及血清CEA水平檢測(cè)二者聯(lián)合應(yīng)用，其敏感性優(yōu)于血清CEA單獨(dú)檢測(cè)，兩者聯(lián)用可以提高結(jié)直腸腺癌診斷的陽(yáng)性率，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。